子宮內膜異位癥患者組織及血清巨噬細胞移動抑制因子、血管內皮生長因子及受體的表達及意義

楊青春

子宮內膜異位癥(endometriosis，EM)是一種育齡期女性常見的婦科良性疾病，該病發病率逐年升高且具有侵襲、轉移等惡性行為，患者主要癥狀有進行性痛經、腰骶痛、月經異常及不孕等，嚴重影響患者生活質量［1，2］。目前，EM的發病機制還未完全闡明，有研究顯示異位子宮內膜的黏附、侵襲和血管形成是該病病灶種植和增殖的關鍵和必備條件［3］。本研究探討EM患者組織及血清巨噬細胞移動抑制因子(MIF)、血管內皮生長因子(VEGF)及其受體(VEGFR1、VEGFR2)的表達及與病情嚴重程度的關系，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年1月至2015年1月我院婦產科收治的需經腹腔鏡手術治療的EM患者45例。所有患者有腰骶痛、進行性痛經、人工流產或不孕史，盆腔檢查可觸及子宮后壁或宮骶韌帶的觸痛結節，B超檢查證實為子宮內膜異位囊腫，術中可見紫藍色粘連結節等，術后經病理確診為EM。排除標準:(1)急慢性感染者;(2)惡性腫瘤患者;(3)合并子宮腺肌癥、子宮肌瘤患者;(4)合并嚴重心腦血管疾病及肝腎疾病患者;(5)近期服用過性激素類藥物者。參照美國生育協會制定的R-AFS分期標準，其中Ⅰ期10例，Ⅱ期12例，Ⅲ期13例，Ⅳ期10例。選取同期于我院體檢的健康女性30例為對照組。2組年齡、腰圍、體重指數(BMI)、FSH/LH、孕次、產次等一般資料比較差異無統計學意義(P＞0.05)，具有可比性。見表1。

表1 2組一般資料比較 ±s

表1 2組一般資料比較 ±s

組別 年齡(歲) 腰圍(m) BMI(kg/m2)FSH/LH對照組(n=30)34.12±5.25 0.75±0.09 24.33±4.22 1.43±0.22觀察組(n=45)33.31±5.57 0.79±0.13 23.68±4.01 1.49±0.24

1.2 主要試劑 兔抗人MIF、VEGF單克隆抗體、VEGFR1、VEGFR2多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。免疫組化SP試劑盒購自上海生工生物工程技術服務有限公司。ELISA試劑盒購自武漢博士德生物有限公司。

1.3 檢測方法

1.3.1 免疫組織化學SP法:標本用10%甲醛固定，石蠟包埋，切成4 μm厚的石蠟切片，65℃烘烤，脫蠟，采用免疫組織化學染色SP法測定MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2的表達，嚴格按照試劑盒說明書操作，用已知陽性切片作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照:3%H2O237℃孵育10 min滅活內源性過氧化物酶，PBS洗滌;微波修復抗原，PBS洗滌;10%山羊血清封閉，室溫孵育10 min;用1∶50稀釋的二抗4℃過夜孵育，PBS沖洗;加生物素標記的抗人IgG抗體室溫孵育30 min，PBS沖洗;辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素室溫孵育30 min，PBS沖洗;DAB顯色;蘇木素染色，封片，光鏡觀察。

1.3.2 微血管密度(MVD)計數:將被CD34單克隆抗體棕色染色的單個內皮細胞或一簇細胞叢作為一個微血管。采用CD34標記的MVD(CD34-MVD)法計數內皮細胞MVD值:100倍光鏡下觀察整個切片，選取3個最有代表性的組織切片，排除存在出血和邊緣反應區的切片。低倍鏡下選出每張切片中3個血管密度最高區(熱區)，400倍光鏡下計數熱區中被抗CD105抗體染成棕色的單個或成簇微血管數，取3個視野的平均值即為該例切片的MVD值。

1.3.3 酶聯免疫吸附試驗(ELISA):抽取患者空腹靜脈血10 ml，3 000 r/min離心10 min，取上清，-80℃保存備用。采用ELISA法測定患者血清MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2表達水平，嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作。

1.4 統計學分析 應用SPSS 10.0統計軟件，計量資料以±s表示，采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗，相關性采用Sperman相關分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2組患者組織MIF、VEGFV、EGFR1、VEGFR2的表達比較 觀察組MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2表達均為陽性，陽性表達率與對照組比較，差異均有統計學意義(P＜0.05)。見表2。

表2 2組患者組織MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2陽性表達比較例(%)

2.2 2組患者血清MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2表達比較 觀察組MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2的表達水平與對照組比較，差異均有統計學意義(P＜0.05)。見表3。

表3 2組患者血清MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2表達比較±s

表3 2組患者血清MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2表達比較±s

注:與對照組比較，*P＜0.05

組別 MIF(ng/ml) VEGF(pg/ml) VEGFR1(pg/ml)VEGFR2(pg/ml)對照組(n=30)7.1±1.2 92.1±12.9 130.2±21.2 225.3±31.6觀察組(n=45) 19.5±3.2* 185.0±25.2* 226.6±33.6* 384.6±46.2*

2.3 2組患者組織MVD計數比較 觀察組MVD計數顯著高于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)。見表4。

表4 2組患者組織MVD計數比較 個/Hp，±s

表4 2組患者組織MVD計數比較 個/Hp，±s

注:與對照組比較，*P＜0.05

組別MVD對照組(n=30)15.7±2.4觀察組(n=45) 35.3±5.7*

2.4 EM患者組織MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2表達與MVD值的相關性 Sperman相關分析顯示，EM患者組織MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2表達與MVD值均呈正相關性(r值分別為0.762、0.814、0.876、0.798，P＜0.05)。

2.5 EM患者組織不同R-AFS臨床分期MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2陽性表達比較 不同R-AFS臨床分期患者組織MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2陽性表達率均不同，R-AFS臨床分期越高者 MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2陽性表達率越高(P＜0.05)。見表5。

2.6 EM患者組織MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2表達與R-AFS臨床分期的相關性 Sperman相關分析顯示，EM患者組織MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2陽性表達率與病變嚴重程度呈正相關性(P＜0.05)。見表6。

表5 EM患者組織不同R-AFS臨床分期MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2陽性表達比較 例(%)

表6EM患者組織MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2表達與R-AFS臨床分期的相關性

2.7 EM患者血清MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2表達與R-AFS臨床分期的相關性 不同R-AFS臨床分期患者血清中MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2表達水平均不同，R-AFS臨床分期越高者MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2表達水平越高(P＜0.05)。Sperman相關分析顯示，子宮內膜異位癥患者血清MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2表達水平與病變嚴重程度呈正相關性(P＜0.05)。見表7、8。

3 討論

EM是子宮內膜樣組織出現在子宮外其他部位，是好發于育齡期女性的常見、慢性婦科疾病，該病具有侵襲性強、易復發的特點，是不孕癥的主要發病原因之一，對患者生育能力和生活質量均造成嚴重影響［1，2］。目前，EM的發病機制尚不清楚，研究顯示EM的發生發展與血管形成、炎性反應、激素水平、細胞免疫或體液免疫等因素有關［3］。

表7 EM患者血清不同R-AFS臨床分期MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2表達比較 ±s

表7 EM患者血清不同R-AFS臨床分期MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2表達比較 ±s

注:與Ⅰ期比較，*P＜0.05;與Ⅱ期比較，#P＜0.05;與Ⅲ期比較，△P＜0.05

類別 MIF(ng/ml) VEGF(pg/ml) VEGFR1(pg/ml) VEGFR2(pg/ml)Ⅰ期(n=10) 6.04±0.93 97.65±10.34 126.35±18.21 230.21±32.28Ⅱ期(n=12 16.10±2.52* 161.23±22.48* 201.59±29.77* 324.16±44.32*Ⅲ期(n=13) 22.73±3.41*# 210.12±30.23*# 263.61±37.55*# 432.65±51.38*#Ⅳ期(n=10) 32.95±3.91*#△ 270.95±42.44*#△ 314.95±48.75*#△ 551.32±59.45*#△

表8 子宮內膜異位癥患者血清MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2表達與R-AFS臨床分期的相關性

巨噬細胞移動抑制因子(MIF)是活化的T細胞、血管平滑肌細胞、巨噬細胞等分泌的一種免疫炎性因子，在糖皮質激素、脂多糖、TNF-α等細胞因子刺激下可誘導釋放，參與調節機體免疫應答、炎性反應、細胞增殖及分化、惡性腫瘤形成等多種生理和病理過程［4］。臨床研究表明MIF在正常組織和血清僅微弱表達，而EM患者在位內膜組織MIF表達增高［5，6］。Pan等［7］研究發現 MIF能夠增強基質金屬蛋白酶(MMPs)降解細胞外基質的能力，從而促進異位內膜細胞的侵襲和植入。有研究發現MIF通過上調血管生成相關基因的表達促進血管生成過程，并通過下調p53基因表達抑制EM患者異位內膜的凋亡［8，9］。以上研究表明MIF從多個環節參與EM的發生及進展，與EM發生密切相關。

研究顯示新生血管形成在EM病理過程中具有至關重要的作用，為異位子宮內膜的移行、種植及增殖提供了必要條件［10］。血管內皮生長因子(VEGF)是迄今發現作用最強的促血管生成因子，與內皮細胞上的受體(VEGFR1和VEGFR2)具有高度親和力，結合后通過促進血管內皮細胞有絲分裂發揮促血管生成作用。研究顯示，血管內皮細胞VEGF通過自分泌方式上調自身表達VEGFR1和VEGFR2，同時VEGFR1和VEGFR2又可正反饋調節VEGF蛋白表達，從而對血管內皮細胞的分化及血管通透性發揮聯合調控作用［11，12］。另外，VEGF還能夠誘導血管內皮細胞表達MMPs并分泌組織蛋白酶，通過對細胞外基質成分的降解減弱了基質的屏障作用，這為血管生長和異位子宮內膜的種植、增殖提供了有利條件，而異位內膜的生長又可表達更多的VEGF，后者進一步刺激新生血管形成，促進了病灶不斷蔓延擴大。本研究結果顯示，子宮內膜異位癥患者組織和血清高表達MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2，與正常子宮內膜組織比較差異有統計學意義(P＜0.05)，且MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2表達與病變嚴重程度呈正相關，與有關研究結果［9，12］一致，說明MIF可能通過上調VEGF、VEGFR1、VEGFR2表達促進了新生血管形成，在子宮內膜異位癥發生發展過程中發揮協同促進作用。此外，本研究表明EM患者微血管密度明顯高于正常人組，差異有統計學意義(P＜0.05)，說明EM患者異位內膜血管內皮細胞增生及新生血管形成較正常內皮細胞異常活躍，促進血管網的形成及異位病灶的蔓延擴散。

綜上所述，本結果表明EM患者高表達 MIF、 VEGF、VEGFR1、VEGFR2，且R-AFS臨床分期高者的表達水平越高，提示MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2在EM血管生成中發揮協同作用。MIF可能通過上調VEGF、VEGFR1、VEGFR2表達誘導新生血管的形成。采用特異性siRNA、抗體或血管生成抑制劑下調MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2表達有望為抑制異位病灶的植入、侵襲和轉移提供基因治療的新靶點。

1 Stilley JA，Birt JA，Sharpe-Timms KL.Cellular and molecular basis for endometriosis-associated infertility.Cell Tissue Res，2012，349:849-862.

2 Gregoric P，Doklestic K，Pandurovic M，et al.Distal ileal endometriosis as a cause of ileus:a case report.Srp Arh Celok Lek，2012，140:225.

3 郎景和.子宮內膜異位癥研究的深入和發展.中華婦產科雜志，2010，45:241-242.

4 Conroy H，Mawhinney L，Donnelly SC.Inflammation and cancer:macrophage migration inhibitory factor(MIF)-the potential missing link. Quart J Med，2010，103:831-836.

5 Herrmann LC，Fraser D，Therriault MJ，et al.Interleukin-1 stimulates macrophage migration inhibitory factor secretion in ectopic endometrial cells of women with endometriosis.Am J Reprod Immunol，2007，58: 505-513.

6 Akoum A，Metz CN，AI-Akoum M，et al.Macrophagem igration inhibitory factor expression in the intrauterineendometrium of women with endometriosis varies with diseasestage，infertility status，and pelvic pain. Fertil Sterilm，2006，85:379-385.

7 Pan X，Mao X，Cheng T，et al.Macrophage migration inhibitory factor:a regulator of MMP13 and inflammation in titanium particles stimulated air pouch in vivo.Mol Cell Biochem，2011，357:313.

8 Baron N，Deuster O，Noelker C，et al.Role of macrophage migration inhibitory factor in primary glioblastoma multiforme cells.J Neurosci Res，2011，89:711.

9 文怡，黃金燕，鐘振東，等.MIF表達與子宮內膜異位癥血瘀證的相關性研究.南京中醫藥大學學報，2013，29:132-134.

10 Kang S，Zhao J，Liu Q，et al.Vascular endothelial growth factor gene polymorphisms are associated with the risk of developing adenomyosis. Environ Mol Mutagen，2009，50:361-366.

11 Goteri G，Lucarini G，Zizzi A，et al.Pro-angiogenetic molecules，hypoxia-inducible factor-1 alpha and nitric oxide synthase isoforms in ovarian endometriosis cysts.Virchows Arch，2010，456:703-710.

12 Cho S，Choi YS，Jeon YE，et al.Expression of vascular endothelial growth factor(VEGF)and its soluble receptor-1 in endometriosis.Microvasc Res，2012，83:237-242.