助仙丹對多囊卵巢模型大鼠卵巢功能及形態的影響

董笑克 魏競競 楊凱 吳迪 李彤 趙丕文 牛建昭

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 21日齡幼年Wistar清潔雌性大鼠60只，體質量(50±5)g，均在21日齡斷乳［北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物生產許可證號:SCXK(京)2012-0001］。

1.1.2 試驗藥物 助仙丹配方顆粒:茯苓15 g、陳皮 15 g、白術 9 g、白芍 9 g、山藥 9 g、菟絲子 6 g、杜仲3 g、甘草3 g(購自北京中醫藥大學東方醫院顆粒藥房);炔雌醇環丙孕酮片(商品名:達英－35，拜耳先靈醫藥股份有限公司);注射用人絨毛膜促性腺激素(上海第一生化藥業有限公司，生產批號:1303031);左炔孕酮硅膠棒(上海達華藥業有限公司，規格:75 mg，生產批號:20121128);血清睪酮酶聯免疫吸附法檢測試劑盒(普博欣試劑公司)。

1.1.3 試驗儀器 電子讀數分析天平(上海民橋精密科學儀器有限公司)，高速離心機(博勵行儀器有限公司)，普通手術器械，顯微鏡(Olympus)，酶聯免疫檢測儀(Tecan)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立 60只大鼠于室溫18～22℃環境下適應2天，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。將實驗大鼠隨機分為2組，空白對照組8只，造模組52只。空白對照組大鼠喂以普通飼料，正常飼養，于27日齡始每天頸背部皮下注射與實驗組等量生理鹽水，共9天。造模組52只大鼠按照朱亮等［2］的方法，適應性喂養3天后于24日齡開始，用1%戊巴比妥鈉溶液麻醉后皮下埋植左旋18-甲基炔諾酮硅膠棒，3 mm/只，27日齡開始皮下注射人絨毛膜促性腺激素1.5 U，2次/天，共9天，35日齡連續陰道涂片2個動情周期［(4～5)天×2］。觀察到陰道涂片染色(陰道涂片染色后觀察顯示無規律動情周期，見大量白細胞，偶見少量角化細胞，處于動情間期時相，提示無排卵，見圖1-A)。陰道涂片提示無排卵則符合PCOS大鼠模型，不符合者剔除。對照組連續陰道涂片2個動情周期全部呈現完整的動情周期，見圖1-B。

圖1 大鼠陰道涂片(次甲基藍染色，放大倍數40×10)

1.2.2 分組及給藥方法 對照組8只，從造模組中挑選出造模成功大鼠共30只，隨機分為模型組10只、助仙丹組10只、炔雌醇環丙孕酮片組10只。助仙丹組與炔雌醇環丙孕酮片組于35日齡開始，于每天18:00藥物灌胃，助仙丹組給予助仙丹配方顆粒水溶液(將助仙丹顆粒2袋溶解于50 mL水中配得含生藥1.38 g/mL藥液)，每只大鼠予生藥8 g/kg助仙丹藥液灌胃;炔雌醇環丙孕酮片組大鼠給予炔雌醇環丙孕酮片(12 g/片，加水50 mL溶解配置0.24 g/mL藥液)，每只大鼠予藥液1.4 g/kg，連續給藥14天。模型組10只以及空白對照組8只，每天以0.58 mL/kg蒸餾水灌胃，1次/天，連續14天。所有大鼠試驗期間均在標準環境內合籠飼養，室溫18～22℃，相對濕度50%，顆粒飼料自由擇食，保持每天光照14小時。

表1 各組大鼠治療前后體質量的變化

1.2.3 標本的收集與處理 將49日齡大鼠禁12小時后稱重后，予1%戊巴比妥鈉0.3 mL/100 g腹腔麻醉，打開腹腔，腹主動脈取血(2～3 mL)，3000 rmp離心，分離血清，－20℃凍存備用。采用酶聯免疫吸附法檢測血清性激素的水平，由普博欣試劑公司完成檢測。摘取雙側卵巢，去除卵巢表面脂肪組織，稱取卵巢質量(濕重)，用10%的多聚甲醛液固定，用不同濃度的乙醇浸泡脫水，常規石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡觀察卵巢的組織形態改變、卵泡的大小發育情況等。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 大鼠一般情況

4組大鼠治療前后均發育良好，體毛潤澤，行為、體征變化無明顯差異，反應靈活。4組大鼠治療前后質量變化值采用單因素方差分析，均服從正態分布;數據具有方差齊性;用 ANOVA分析，F=4.753，P=0.007 ＜0.05，可以認為四組治療前后質量變化值有顯著差異。采用LSD法進行兩兩比較，結果表明:與模型組比較，炔雌醇環丙孕酮片組大鼠用藥前后體質量增加顯著減少(P＜0.05)。結論:助仙丹顆粒配方組、炔雌醇環丙孕酮片組大鼠用藥前后體質量的增加均小于模型組，其中炔雌醇環丙孕酮片組大鼠體質量增長更少，說明炔雌醇環丙孕酮片對于多囊卵巢模型大鼠體質量具有明顯降低作用，兩組相比，助仙丹組大鼠體質量變化與空白對照組大鼠相比無差異(P＞0.05)。

2.2 卵巢質量及血清雄激素水平

大鼠卵巢質量及血清雄激素水平變化均采用單因素方差分析，各組之間兩兩比較采用LSD法。與空白對照組比較，模型組大鼠卵巢質量明顯增加(P＜0.05);與模型組比較，炔雌醇環丙孕酮片組大鼠卵巢質量降低明顯(P＜0.05)，模型組大鼠卵巢濕重明顯高于正常組大鼠卵巢濕重，而炔雌醇環丙孕酮片組、助仙丹組大鼠卵巢濕重均不同程度的下降。大鼠血清雄激素水平經單因素方差分析，F=0.726，P=0.544 ＞0.05，認為四組大鼠血清雄激素水平沒有明顯差異，具體見表2。

表2 各組大鼠雙側卵巢濕重及血清雄激素比較

2.3 卵巢光鏡結果

空白組可見處于不同分化等級的卵泡，顆粒細胞層較厚，排列整齊，卵巢組織可見正常成熟卵泡、黃體以及白體;模型組大鼠卵巢內罕見成熟卵泡，卵巢內有數量較多的閉鎖卵泡，卵泡內顆粒層薄(2～3層)，卵巢組織內少見黃體及白體;炔雌醇環丙孕酮片組卵巢切片可見成熟卵泡及處于不同階段的卵泡，閉鎖卵泡較模型組明顯減少，顆粒層細胞數較模型組稍有增厚，但明顯少于正常組;助仙丹顆粒配方組大鼠卵巢中可見成熟卵泡及一定數目閉鎖卵泡，顆粒細胞層較模型組及炔雌醇環丙孕酮片組均明顯增加，接近空白對照大鼠顆粒層數目，但排列欠整齊，卵巢內可見正常一定數目的黃體及白體。

圖2 各組大鼠卵巢切片(HE染色，放大倍數:4×10)

3 討論

PCOS是婦科內分泌臨床常見病，在排卵功能障礙不孕患者中占90%［3］，育齡婦女患PCOS的概率為5% ～10%，約占婦科內分泌臨床病例數的20% ～60%，在閉經婦女中占25%［4］。PCOS的臨床表現具有異質性，其病理生理也較為復雜，除對生活質量產生不利影響外，還易出現不孕癥、高胰島素血癥及心血管疾病等并發癥［5］。而且流行病學資料顯示隨著兒童期和青春期肥胖發生率的增高，青春期PCOS的發病率也有所增高，因此對于多囊卵巢綜合征的病因病機以及治療等的相關研究具有較為重要的臨床意義。但目前又無治療多囊卵巢綜合征的特效藥，近年來隨著中醫藥對其研究的深入，中醫藥治療PCOS已顯示其優勢。助仙丹選自著名的女科專著《傅青主女科》，原方被用來治療“經水數月一行”，傅青主評價此方“健脾益腎而不滯，解郁清痰而不滯”。而中醫對于PCOS的中醫病機認識多為脾腎兩虛、痰濕阻滯、肝郁血瘀等。助仙丹中菟絲子、杜仲可溫補腎氣，腎氣足自可化濁，茯苓、山藥、白術等補脾氣，脾氣足則不生痰，痰濁即去，白芍可解肝郁、舒肝氣，方義與現代醫家對多囊卵巢綜合征的認識較為一致，所用藥物均為婦科常用藥物，平補而不滯。

高雄激素血癥、卵巢多囊性改變、稀發排卵是PCOS較為特征性的改變，本研究就血清雄激素、卵巢形態等多方面研究分析助仙丹對多囊卵巢綜合征的作用效果及機理初探。結果表明，助仙丹可促進多囊卵巢綜合征大鼠排卵并增加卵泡顆粒細胞層細胞數目、黃體組織數目，減少囊狀卵泡數目;與炔雌醇環丙孕酮片相比，助仙丹藥效較為溫和，對于增加顆粒細胞數有明顯優勢，但在改善體重、卵巢濕重方面效果不如炔雌醇環丙孕酮片明顯。本研究表明助仙丹對PCOS大鼠卵巢形態、體質量、卵巢濕重等具有改善作用，尤其對顆粒細胞層數增加有明顯作用，顆粒細胞可將雄激素轉化為雌激素，從而降低血清雄激素的含量，糾正多囊卵巢綜合征的高雄激素血癥，進而促進排卵、改善癥狀。本研究提示助仙丹加減對PCOS有一定的治療作用，但其確切的機理仍待進一步研究。

另外本實驗仍有一些方面有待改善:(1)大鼠PCOS模型不夠持久，且造模成功率低，其造模結果與人類PCOS仍有不同;(2)助仙丹藥味少，各藥劑量小，作用也較炔雌醇環丙孕酮片弱，考慮按照不同證型的PCOS，調整助仙丹劑量，并可設立高、中、低劑量組，尋找助仙丹治療多囊卵巢綜合征的最佳有效劑量;(3)炔雌醇環丙孕酮片與助仙丹比較，炔雌醇環丙孕酮片在促進排卵方面占優勢，助仙丹在促進卵巢形態恢復、增加顆粒層細胞的數目方面有明顯的優勢，中西藥聯用是否有更好地療效仍待進一步研究;(4)因實驗經費及周期的限制，實驗所用血清學指標較少，可進一步研究更多的性激素改變的結果，以求為助仙丹臨床應用取得更多證據。

［1］DiamanTik E，Kouli CR，Bergiele AT，et al.A survey of the polycystic ovary syndrome in the greek island of Lesbos:hormonal and metabolic profile［J］.J Clin Endocrinol Metab，1999，84(11):4006-4011.

［2］朱亮，邢福祺，全松，等.避孕硅膠棒聯合HCG誘導SD大鼠多囊卵巢綜合征模型的建立［J］.第四軍醫大學學報，2009，30(6):534-536.

［3］李曉紅，李紅.不孕不育的病因［J］.中國全科醫學，2003，6(11):887-889.

［4］曹澤毅，中華婦產科學［M］.北京:人民衛生出版社，1999:2177-2196.

［5］Friedman JM，Leibel RL.Tackling a weighty problem［J］.Cell，1992，69(2):217-220.