中國南北方食管癌患者中p53基因外顯子突變譜的差異研究

洪　強　譚家駒　姚維深　羅學平　周國華　謝敬廉　莫春生

作者單位：528200 廣東省佛山市南海區人民醫院胸外科(洪　強，姚維深，羅學平，周國華，謝敬廉，莫春生)；528000 廣東省佛山市第一人民醫院胸外科(譚家駒)

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中國南北方食管癌患者中p53基因外顯子突變譜的差異研究

洪強譚家駒姚維深羅學平周國華謝敬廉莫春生

作者單位：528200 廣東省佛山市南海區人民醫院胸外科(洪強，姚維深，羅學平，周國華，謝敬廉，莫春生)；528000 廣東省佛山市第一人民醫院胸外科(譚家駒)

【摘要】目的探討南北方食管癌患者中抑癌基因p53全部編碼外顯子基因突變譜的差異。方法各選取揭陽居民食管癌患者42例，佛山患者52例，常規提取DNA，PCR擴增p53第2-11外顯子全部編碼區和附近的一部分非編碼區，擴增產物用DHPLC進行突變的篩查。篩查出的突變樣本進行DNA純化測序分析，測序結果在NCBI網站進行p53突變位點的比對和定位。結果高、低發區組中p53至少有1個外顯子基因突變的突變率分別為63.8%(28/42)和61.5%(32/52)，兩者比較差異無統計學意義(P=0.607>0.05)； p53有2個外顯子基因突變的突變率分別為14.3%(6/42)和15.4%(8/52)，兩者比較差異也無統計學意義(P=0.881>0.05)。結論高低發區間可能具有相似的環境致癌物質，通過相同的p53基因突變機制導致了兩地食管癌的發生。

【關鍵詞】食管癌；變性高效液相色譜；基因突變

(ThePracticalJournalofCancer,2015,30:0039～0042)

食管癌發病率具有明顯的地理分布特征。氮循環病因假說是現有多種食管癌的病因假說之一，氮循環中的硝酸鹽、亞硝酸鹽；胺類、酰胺類。這兩類前體物進入人體，合成亞硝酰胺及亞硝胺，引發肝癌、胃癌、食管癌[1]。p53基因是迄今發現與人類腫瘤相關性最高的基因[2-4]，p53是致癌劑作用的靶基因之一，細胞暴露于不同的致癌劑時，常表現為不同的突變譜。本研究分析南方食管癌高低發區居民食管癌患者p53基因全部編碼外顯子基因突變譜的情況，比較兩者p53基因突變的差異，進一步探索食管癌發生發展的分子生物學變化，為兩者間是否存在相同或機似的環境致癌因素提供分子生物學依據。

1材料與方法

1.1研究對象

南方高發區組42例中男性32例，女性10例，年齡46～70歲，中位年齡59歲，來源于高發地區揭陽市人民醫院的食管癌手術標本。佛山低發區組52例中，男性45例，女性7例，年齡44～78歲，中位年齡61歲，來源于低發區佛山市第一人民醫院胸外科的食管癌手術標本。所有患者術前均未經過放療和化療，手術標本離體后迅速沿切緣到腫瘤方向從癌腫中間切分成兩半，每半包括癌組織、癌旁組織、手術切緣組織三個部分，將一半凍存于液氮中然后轉入-70℃冰箱保存，另一半用10%福爾馬林液固定后送作病理診斷。所選標本切除后病理檢查證實為鱗狀細胞癌，癌旁組織均超過癌腫邊緣3 cm。

1.2實驗方法

1.2.1基因組DNA提取從-80℃冰箱中取出組織，切取食管癌組織25～30 mg，用TIANGEN組織基因組DNA提取試劑盒提取DNA。

1.2.2PCR反應擴增目的片段PCR反應引物根據有關文獻報道[13]，并在美國國立生物技術信息中心(NCBI)網站數據庫進行比對。擴增的7個片段包括了p53外顯子、外顯子和內含子交界區的非編碼序列。

1.2.3DHPLC檢測基因突變PCR產物不作任何純化處理，直接用于DHPLC分析。

1.2.4有突變峰型樣本DNA片段進行基因測序經DHPLC篩選出來的有突變峰型樣本DNA，在相同條件下PCR擴增50 μl產物送測序公司進行DNA的純化測序。相同的突變峰型只選取一個樣本DNA進行測序。

1.3統計分析

應用SPSS 16.0統計軟件進行分析，記數資料采用χ2檢驗。取雙側P，P<0.05為有統計學意義。當N≥40，1≤T<5時，用連續性校正χ2值。N<40或有T<1時，用四格表的確切概率法。

2結果

將658份PCR擴增產物進行DHPLC的篩查，如DHPLC峰型圖譜顯示為單峰，則表示被檢測樣品沒有發生突變；如DHPLC峰型圖譜顯示為雙峰或多峰，則表示該檢測樣品有基因異常；如果被檢測樣品間的異常DHPLC 峰型圖譜相同，則表示這些被檢測樣品之間有相同的基因突變類型。

2.1高、低發區p53基因突變的發生與食管癌生物學行為的關系

兩組標本的p53 基因突變與患者性別、年齡及癌腫部位無明顯的相關性(P>0.05)，與腫瘤組織分化、臨床病理分期和淋巴結轉移也無明顯的相關性(P>0.05)，見表1。

2.2 高、低發區p53基因突變率的比較

高、低發區p53基因PCR產物突變率比較差異無統計學意義(P=0.816>0.05)，見表2。

高低發區患者基因突變率比較差異無統計學意義(χ2=0.065，P=0.607>0.05)，見表3。

表2　南方高低發區PCR產物突變情況比較/例

表3　南方高低發區患者基因突變情況比較/例

2.3突變基因測序結果

將DHPLC篩查出的有突變峰型病例的相應外顯子在相同條件下進行PCR 擴增，擴增出產物50 μL送廣州景瑞生物科技有限公司進行純化測序。同一外顯子不同病例間有相同突變峰型的，只選取一個病例的PCR 擴增產物進行純化測序，共36個樣品測序。

在美國國家生物技術信息中心(NCBI)網站，查找到p53基因全序列(U94788)及p53的密碼子序列(CCDS11118.1)，并在NCBI網站將各個樣本的測序結果與p53基因全序列及CDS序列分別進行比對。在高發區居民的p53外顯子突變譜中，共有14種突變類型，共計41個突變位點，其中最多的突變類型是插入堿基C，共10例；其次為C→T轉換，共5例，G→T、T→G轉換均為4例。編碼區的突變類型有9種，14例，主要以G→T、T→C、G→A轉換為主，共計8例，占編碼區的突變類型的57.1%。在低發區居民的p53外顯子突變譜中，共有10種突變類型，共計35個突變位點，其中最多的突變類型是C→T、T→G轉換，各6例；其次為G→C、G→T、G→A轉換，各4例。編碼區的突變類型有6種，14例，主要以G→T、G→A、C→A轉換為主，共計10例，占編碼區的突變類型71.4%。

3討論

食管癌發病率在不同地理區域內有巨大的差異，說明特定的環境因素對其發生起著重要作用。p53基因是迄今發現與人類腫瘤相關性最高的抑癌基因，在環境致癌物質誘發腫瘤的過程中，p53是最常受累的靶基因之一[2-4]，它的突變與人類50%的腫瘤發生有關[5]。

研究表明，p53基因突變在南方高低發區居民食管癌發生發展中是一個發生頻率很高的事件，高發區組和低發區組患者都有p53的突變，p53突變在兩組患者中的頻率沒有明顯差別。楊勝利等用同樣的方法發現林州居民食管癌中p53突變率為68.3%[6]，與本實驗相似，這些提示了高低發區間可能有共同的致p53突變因素在起作用，高、低發區間食管癌的發生可能具有共同的發病機制。食管癌臨床病理分期Ⅰ+Ⅱ和Ⅲ+Ⅳ在高發區和低發區中p53陽性率相似，差別無統計學意義。p53基因突變有可能成為預測食管癌變危險性的生物標志，而且在食管癌的發展過程中并未見到p53突變率的顯著增高，這說明在食管癌的進程中可能還有其他基因的參與，這與Christian BJ等的結果是一致的[7-8]。

p53是致癌劑作用的靶基因之一，細胞暴露于不同的致癌劑時，常表現為不同的突變譜，SHIGEKO S等對中國河北省的高低發區p53不同突變類型進行了比較，無論是高發區還是低發區，點突變都是最常見的，分別占86.8%和66.7%[9]。甲基芐基亞硝胺(NMBzA)誘發的人胎兒食管癌，NMBzA處理人胎兒食管上皮和NMBzA灌胃猴的食管上皮中發現有Rb、p53、APC和MCC的缺失和突變[10-11]。NMBzA處理的人胎兒食管上皮與猴食管上皮組織中，p53基因突變的指紋均能在人原發性食管癌中找到，在人原發性食管癌40.9%(9/22)的p53突變與NMBzA誘發的p53突變有相同指紋譜，大部分是G→T、G→A轉換[12]。用N-戊基-N-甲基亞硝基胺(AMN) 處理后的人食管正常組織標本中，42.19 %(6/14) 檢測出p53 基因突變，其中主要的突變亦為G→A轉換[13]。本研究發現在高低發區居民的p53 外顯子突變以點突變為主。提示了南方高、低發區和上述其他地區的食管癌可能具有相同的環境致癌因素及發病機制，其癌變可能都經歷了p53基因突變的過程。機體的遺傳物質在環境致癌物N-亞硝基化合物的作用下發生遺傳學變異，這在高、低發區食管癌的發生過程中可能起著重要的作用。

引起我們注意的是，為什么發病率差異明顯的高、低發區食管癌標本的p53基因突變率會無差異呢？既然高、低發區間食管癌的環境致癌物及發病機制相同，又是什么因素導致兩地間的食管癌發病率相差數十倍呢？“氮循環”病因假說[1]提出了有效污染濃度與有效污染比率的概念，解釋了上述現象：當人體接觸的環境致癌物N-亞硝基化合物及其兩類前體物達到有效致癌劑量時便可得癌，而有效污染比例的大小則決定了癌變人群的多少而形成高、低發區。

參考文獻

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[12]李華川，陸士新，崔曉邢，等.人食管癌與NMBzA引起的人和猴食管上皮細胞中多種抑癌基因變化的相關性研究〔J〕.中華腫瘤雜志，1995，17(4)：249-253.

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(編輯：吳小紅)

Comparative Study on the Mutation Spectrum of p53 Coding Exons in Esophageal

Carcinomas in Southern and Northern China by DHPLC

HONGQiang，TANJiaju，YAOWeishen，etal.NanhaiHospitalAffiliatedtoSouthernMedicalUniversity，Foshan，528200

【Abstract】ObjectiveTo compare the mutation spectrum of p53 coding exons in esophageal carcinomas in southern and northern China by denaturing high performance liquid chromatography(DHPLC).Methods42 and 52 cases of esophageal carcinomas were respectively collected from the high and low risk areas in southern China.The 2-11 coding exons of p53 (including all coding area and part of non-coding area) were amplifyied by PCR after DNA routine extraction.DHPLC was processesd for mutation screening of the products after PCR.Then those with mutations were purified and sequenced of their DNAs.The results were compared with the sequence of wild p53 on NCBI website.The locations of the mutations were confirmed.Information was obtained of the p53 mutations spectrum in the patients from the high and low risk areas.ResultsIn the high risk area group，28 specimens were found with at least 1 coding exon mutations，the p53 mutation rate was 63.8%(28/42)；In the low risk area group，32 pecimens were found with at least 1 coding exon mutations，the p53 mutation rate was 61.5%(32/52)，the difference had no statistic significance between the 2 groups(P=0.881>0.05).ConclusionLow and high risk areas may have a similar range of environmental carcinogens，through the same mechanism of p53 gene mutation leads to the occurrence of esophageal cancer.

【Key words】Esophageal Carcinoma；Denaturing high performance liquid chromatography(DHPLC)；Gene mutation

(收稿日期2014-04-29修回日期 2014-09-30)

中圖分類號：R735.1

文獻標識碼：A

文章編號：1001-5930(2015)01-0039-04

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2015.01.011