羅格列酮逆轉絲裂霉素對人胃癌SGC7901/VCR祼鼠移植瘤耐藥作用的研究

廖文秋　張　琍　李國慶　劉小葉

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羅格列酮逆轉絲裂霉素對人胃癌SGC7901/VCR祼鼠移植瘤耐藥作用的研究

廖文秋張琍李國慶劉小葉

【摘要】目的探討PPARγ激動劑羅格列酮(ROS)逆轉人胃癌SGC7901/VCR細胞裸鼠移植瘤對絲裂霉素(MMC)的耐藥作用及其可能機制。方法建立人胃癌SGC7901/VCR細胞裸鼠移植瘤模型，將48只裸鼠隨機分為6組：空白對照組(生理鹽水0.2 ml)、MMC組(MMC 2.5 mg/kg)、ROS組(ROS 100 mg/kg)、MMC+ROS中劑量組(MMC 2.5 mg/kg+ROS 50 mg/kg)、MMC+ROS高劑量組(MMC 2.5 mg/kg+ROS 100 mg/kg)、MMC+CSA組(MMC 2.5 mg/ kg+CSA 50 mg/kg)。每組8只裸鼠；用藥40天后，觀察各組裸鼠體重和移植瘤體積變化，計算抑瘤率，繪制移植瘤的生長曲線；Western-blot法檢測P-gp和MGr1-Ag蛋白的表達。結果空白對照組、MMC組移植瘤瘤體積和抑瘤率差異無顯著性，ROS組、MMC+ROS中劑量組、MMC+ROS高劑量組組、MMC+CSA組與空白對照組、MMC組比較，移植瘤瘤體積和抑瘤率差異有顯著性。空白對照組、MMC組中P-gp、MGr1-Ag蛋白表達最強，ROS組、MMC+ROS中劑量組、MMC+ROS大劑量組、MMC+CSA組與空白對照組和MMC組P-gp、MGr1-Ag蛋白表達比較有統計學意義(P<0.05)，MMC+ROS大劑量組、MMC+CSA組中其表達最弱，組間差異無統計學意義(P>0.05)。結論羅格列酮可抑制人胃癌SGC7901/VCR細胞祼鼠移植瘤瘤體生長，羅格列酮可下調人胃癌SGC7901/VCR細胞裸鼠移植瘤組織中P-gp和MGr1-Ag蛋白的表達。羅格列酮可部分逆轉人胃癌SGC7901/VCR細胞祼鼠移植瘤對絲裂霉素的耐藥性。

【關鍵詞】羅格列酮；多藥耐藥；移植瘤；P-gp蛋白；MGr1-Ag蛋白

(ThePracticalJournalofCancer,2015,30:0006～0009)

腫瘤的多藥耐藥性(multidrugresistance，MDR)是腫瘤化療失敗的重要原因。P糖蛋白(P-glycolprotein，P-gp)的過度表達是MDR產生的主要原因[1]，MGr1-Ag是近發現一個新的耐藥相關分子[2]。尋找能有效逆轉MDR的逆轉劑是當前腫瘤化療亟待解決的難題。羅格列酮是過氧化物酶體增殖因子活化受體(peroxisome proliferateration-activated receptor gamma，PPARγ)激動劑，調控細胞周期、抑制炎癥反應、誘導腫瘤細胞分化和凋亡等作用[3]。近年來發現羅格列酮還能逆轉腫瘤多藥耐藥[4-5]。目前這些研究大部分在體外。本研究旨在模擬人體內腫瘤生長環境，探討羅格列酮逆轉腫瘤多藥耐藥的作用及其機制，為臨床羅格列酮治療多藥耐藥腫瘤患者提供一定的理論依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株和動物人胃癌多藥耐藥細胞株SGC7901/VCR購自中南大學腫瘤研究所；6~8周齡雄性BABL/c小鼠，48只、A級，許可證號：SCXK(滬)2012-0005(上海斯萊克實驗動物有限責任公司)。

1.1.2主要試劑RPMI-1640培養基購于Gibco BRL公司；長春新堿為深圳萬樂有限公司生產；羅格列酮購于武漢遠城科技發展有限公司；絲裂霉素購于浙江海正藥業股份有限公司。P-gp抗體購于美國Santa Cruz公司；Anti—MGr1-Ag/37LRP購于北京博奧森生物技術有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養SGC7901/VCR細胞置于含1 mg/L長春新堿(VCR)的10%小牛血清RPMI-1640培養基中培養維持耐藥，置于37℃、95%飽和濕度、含5%CO2孵箱中培養，每1～2天換一次液，于細胞80%匯合時，用0.25%的胰酶細胞消化液消化，1∶2或1∶3傳代一次。實驗前2周撤除VCR。

1.2.2動物實驗將人胃癌SGC7901/VCR細胞收集后接種于裸鼠背部皮下，觀察移植后裸鼠的成瘤情況，術后兩周將48只成瘤裸鼠隨機分為6組：空白對照組(生理鹽水0.2 ml灌胃)、MMC組(MMC 2.5 mg/ kg腹腔注射)、ROS組(ROS 100 mg/ kg灌胃)、MMC+ROS中劑量組(MMC 2.5 mg/ kg腹腔注射+ROS 50 mg/ kg灌胃)、MMC+ROS高劑量組(MMC 2.5 mg/ kg腹腔注射+ROS 100 mg/ kg灌胃)、MMC+CSA組(MMC 2.5 mg/ kg腹腔注射+CSA 50 mg/ kg灌胃)。每組8只裸鼠；待移植瘤體積長至約100 mm3時開始分別給每組裸鼠灌胃給藥(均為1次/2天)，每5天分別測量每只裸鼠移植瘤的體積，40天后處死動物，計算抑瘤率，并據此繪制移植瘤的生長曲線。腫瘤體積=(長徑×短徑2)/2；抑瘤率=(對照組腫瘤體積-實驗組腫瘤體積)/對照組腫瘤體積×100%。

1.2.3Western蛋白印跡檢測裸鼠移植瘤中P-gp和MGr1-Ag蛋白表達取80 mg移植瘤組織，加入1 ml Trizol和0.5 μl PMSF，用研磨器反復研磨，離心后上清液即用于測定總蛋白，BCA法測定蛋白質的濃度，微量加樣器吸取煮好的蛋白(25 μl)上樣，SDS-PAGE電泳，轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，TBST洗膜，每次15 min，共3次，加入一抗工作液 (兔抗人P-gp1∶400、兔抗人Anti--MGr1-Ag/37 LRP 1∶400)，4℃孵育過夜。次日TBST洗膜，每次15 min，共3次，加二抗HRP標記IgG(山羊抗兔1∶6 000)；室溫孵育60 min，用TBST洗膜，每次15 min，共3次。然后加入化學發光劑，再放入暗盒并壓片，顯影、定影。將膠片進行掃描或拍照，用凝膠圖像處理系統分析目標帶的分子量和凈光密度值，以目的條帶與內參照條帶比值代表蛋白表達水平。

1.3統計學分析

2結果

2.1各組裸鼠移植瘤體積變化(表1)

與空白對照組比較，MMC組移植瘤體積差異無顯著性(P>0.05)。ROS組、MMC+ROS中劑量組、MMC+ROS高劑量組及MMC+CSA組與空白對照組和MMC組比較，移植瘤體積均明顯縮小(P均<0.05)，其中以MMC+ROS高劑量組、MMC+CSA組的體積縮小最明顯。由表1及圖1可看出，絲裂霉素對移植瘤生長無明顯抑制作用(P>0.05)，羅格列酮或絲裂霉素聯合羅格列酮或環孢霉素A對移植瘤生長有抑制作用(P<0.05)，MMC+ROS高劑量組和MMC+CSA組的抑制作用最強，羅格列酮抑制移植瘤的作用呈劑量依賴關系。

2.2Western蛋白印跡檢測裸鼠移植瘤中P-gp和MGr1-Ag蛋白表達

各組裸鼠移植瘤P-gp/β-actin值分別為(0.83±0.02)、(0.82±0.02)、(0.78±0.03)、(0.69±0.03)、(0.63±0.05)、(0.60±0.03)。各組裸鼠移植瘤MGr1-Ag/β-actin值分別為(1.04±0.04)、(1.02±0.04)、(0.97±0.04)、(0.92±0.03)、(0.86±0.03)、(0.83±0.03)。P-gp和MGr1-Ag蛋白表達以空白對照組最高，MMC組與空白對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)，ROS組、MMC+ROS中劑量組、MMC+ROS高劑量組、MMC+CSA組與空白對照組和MMC組比較差異有統計學意義(P<0.05)；MMC+ROS高劑量組、MMC+CSA組P-gp和MGr1-Ag蛋白表達最低，組間差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2。

表1　各組移植瘤體積及抑瘤率情況±s)

注：a為P>0.05，與空白對照組比較；b為P<0.05，與空白對照組、MMC組比較；c為P<0.05，與ROS組比較；d為P<0.05，與MMC+ROS中劑量組比較；e為P>0.05，與MMC+ROS高劑量組比較。

A組為空白對照組；B組為MMC組；C組為ROS組；D組為MMC+ROS中劑量組；E組為MMC+ROS高劑量組；F組為 MMC+CSA組。

圖1各組移植瘤生長曲線圖

3討論

腫瘤多藥耐藥的機制是多因素、多途徑綜合作用的結果，MDR 形成的機制異常復雜，研究表明由MDR1編碼的P-gp的過度表達所介導的耐藥是經典的耐藥途徑[4]。近年研究[6]表明，MDR1/P-gp 高表達和凋亡抑制是化療藥物誘發腫瘤細胞MDR的主要機制。P-gp是1種跨膜糖蛋白，由1 280個氨基酸殘基組成，分子量為170 kD，是一個能量依賴性的藥物排出泵，通過ATP水解供能，逆濃度梯度將藥物泵出細胞外，導致細胞內藥物濃度降低而產生耐藥。樊代明等[2，7]在胃癌細胞多藥耐藥性研究中，發現一個新的耐藥相關分子MGr1-Ag。MGr1-Ag是1種表觀分子量約為42 kD，等電點約為4.8，抗原表位由氨基酸構成的蛋白質，單克隆抗體MGr1-Ag能部分逆轉SGC7910/VCR細胞對ADM、VCR、5-Fu的耐藥性，明顯增加SGC7901/VCR細胞對ADM的蓄積和潴留。Sun等[8]發現MGr1-Ag可通過上調MRP，下調凋亡相關基因bcl、bax的表達，從而減少胞內藥物蓄積，抑制藥物誘導的凋亡作用。Liu 等[9]發現MGr1-Ag 基因所編碼的氨基酸序列與人37 kD 層粘連蛋白受體前體蛋白(37LRP)的氨基酸序列完全相同。缺氧誘導的胃癌耐藥與上調MGr1-Ag的表達有關，抑制HIF-1的表達能夠明顯抑制缺氧誘導的MGr1-Ag的mRNA和蛋白水平。

1為空白對照組；2為MMC組；3為ROS組；4為MMC+ROS中劑量組；5為MMC+ROS高劑量組；6為MMC+CSA組。

圖2Western blot檢測結果

已有研究證實環孢霉素及其衍生物在體內體外能逆轉MDR作用[10]。目前多藥耐藥的逆轉劑多存在體內活性小，毒副作用大的缺點，理想的MDR 逆轉劑應具有毒副作用低而本身有抗癌活性特點。羅格列酮是過氧化物酶體增殖因子活化受體(peroxisome proliferateration-activated receptor gamma，PPARγ)激動劑，有文獻[11]報道羅格列酮能抑制癌細胞增殖及促進其凋亡的作用。文瀾等[12]研究說明羅格列酮能抑制腫瘤的生長轉移和血管發生，此外，羅格列酮可以通過下調某些腫瘤細胞P-gP蛋白的表達，從而逆轉由MDR1所介導的腫瘤多藥耐藥[5]。這些研究提示羅格列酮有可能作為某些化療藥物的增敏劑而逆轉腫瘤的多藥耐藥。本實驗應用羅格列酮聯合MMC對人胃癌SGC7901/VCR裸鼠移植瘤模型進行干預處理：發現空白對照組、MMC組腫瘤體積增長明顯，ROS組、ROS聯合MMC組及CSA聯合MMC組瘤體增長相對緩慢，差異有統計學意義(P<0.05)。通過Western blot檢測P-gp和MGr1-Ag蛋白的表達，發現ROS聯合MMC組和CSA聯合MMC組P-gp 和MGr1-Ag蛋白的表達明顯降低，與空白對照組、MMC組比較差異有統計學意義(P<0.05)。推測ROS可能通過下調P-gp和MGr1-Ag蛋白的表達，減少了細胞膜上P-gp的數量，影響了其功能，阻止了藥物的外排，從而使細胞內藥物濃度得以提高，達到殺滅腫瘤細胞的藥物濃度，逆轉了腫瘤耐藥。

本組研究提示人胃癌SGC7901/VCR裸鼠移植瘤對MMC耐藥，ROS和CSA能逆轉人胃癌SGC7901/VCR裸鼠移植瘤對MMC耐藥性，可能為臨床逆轉胃癌化療耐藥提供新的途徑，我們認為不良反應較少的ROS對于逆轉胃癌多藥耐藥性具有重要意義，但ROS逆轉MDR調控機制有待進一步探討。

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(編輯：吳小紅)

Research on Rosiglitazone Reversal Mitomycin C on Drug Resistance of Nude Mice

Xenografts of Human Gastric Cancer SGC7901/VCR Cells

LIAOWenqiu，ZHANGLi，LIGuoqing，etal.TheSecondAffiliatedHospitalofUniversityofSouthChina，Hengyang，421001

【Abstract】ObjectiveTo explore the effect of rosiglitazone(ROS)，a selective peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ) ligand，reverses Mitomycin C resistance on nude mice xenografts of human gastric cancer SGC7901/VCR cells and its possible mechanism.MethodsThe model of xenografts tumor in nude mice were established by inoculating human gastric cancer SGC7901/VCR cells into the back of nude mice subcutaneously.48 male nude mice were divided into 6 groups：Control group，MMC group，ROS group，MMC combined moderate dose ROS group，MMC combined high dose ROS group，MMC combined cyclosporineA(CSA) group.There were 8 mice in each group.After treated for 40 days，the volumes changes of tumor and tumor inhibition rates were observed，draw the growth curve of xenograft tumor.The expression of P-glycolprotein(P-gp) and MGr1-Ag were observed with Western-blot assay respectively.ResultsAfter medication the effect on the volume of tumor and tumor inhibition rates：there was no significant difference between the control group and MMC group(P>0.05)，the difference of tumors volume and tumor inhibition rates were significant between other groups and the control group and MMC group (P<0.05).The expression of P-gp and MGr1-Ag was highest in the control group and MMC group，the difference of expression of P-gp and MGr1-Ag were significance between other groups and control group and MMC group (P<0.05).MMC combined high dose ROS group and MMC combined cyclosporineA(CSA) group were least，there was no significant difference between them(P>0.05).ConclusionRosiglitazone inhibits the growth of SGC7901/VCR cell and decreases the expression of P-gp and MGr1-Ag，Rosiglitazone reverses drug resistance of nude mice xenografts of human gastric cancer SGC7901/VCR cells partly on MMC.

【Key words】Rosiglitazone；Multidrug resistance；Xenograft；P-gp protein；MGr1-Ag protein

(收稿日期2014-03-25修回日期 2014-04-18)

中圖分類號：R735.7

文獻標識碼：A

文章編號：1001-5930(2015)01-0006-04

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2015.01.002

通訊作者：張琍

基金項目：湖南省科技廳資金資助項目(編號：2009SK3138)；湖南省自然科學基金資助項目(編號：08JJ5002)；湖南省衛生廳資助項目(編號：2007110)
作者單位：421001 南華大學附屬第二醫院