肺癌患者血清及組織中miR指標(biāo)的變化分析

龔　星

作者單位:441000 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽醫(yī)院

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肺癌患者血清及組織中miR指標(biāo)的變化分析

龔星

作者單位:441000 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽醫(yī)院

【摘要】目的分析肺癌患者血清及組織中miR表達(dá)變化及其臨床意義。方法收集48例肺癌住院患者作為肺癌組，納入同時(shí)期體檢的健康志愿者20例作為對照組。采用RT-PCR法對血清和組織中miR-21、miR-31、miR-155表達(dá)水平進(jìn)行檢測，比較組間差異。結(jié)果肺癌患者血清miR-21、miR-31、miR-155表達(dá)水平顯著高于對照組；肺癌組織中miR-21、miR-31、miR-155表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，P<0.05。血清miR-21、miR-31、miR-155表達(dá)水平越高的肺癌患者TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度更高，預(yù)后則較差，P<0.05。結(jié)論肺癌患者血清及組織中miR-21、miR-31、miR-155呈高表達(dá)，血清microRNAs檢測可以作為肺癌初步診斷的指標(biāo)，用于輔助判斷肺癌的惡化程度和預(yù)測預(yù)后。

【關(guān)鍵詞】肺癌；miR；血清；組織

(ThePracticalJournalofCancer,2015,30:645～647)

肺癌是威脅人類生命健康的首位惡性腫瘤[1]，如何提高肺癌的檢出率對改善肺癌患者的預(yù)后十分關(guān)鍵。醫(yī)學(xué)界一直致力于尋找腫瘤標(biāo)志物用于肺癌的診斷，大量研究顯示miR有可能成為肺癌診斷的新指標(biāo)，為肺癌的臨床診斷、治療選擇和預(yù)后判斷提供更為可靠的依據(jù)[2-6]。然而目前大多數(shù)研究都只關(guān)注了肺癌組織中miR表達(dá)變化，因此只有當(dāng)手術(shù)切除后經(jīng)病理檢測才能獲取miR表達(dá)的信息，失去了miR在肺癌前期診斷中的應(yīng)用價(jià)值。最近開始有研究關(guān)注腫瘤患者血清中的miR水平，以用于各種腫瘤的診斷[7-8]。本次研究我們對肺癌患者血清及組織中miR表達(dá)進(jìn)行了較為綜合和全面的探索，以期為肺癌的臨床診斷提供更加簡單、易測的指標(biāo)。

1材料與方法

1.1臨床資料

收集2012年7月至2013年9月期間來我院就診的經(jīng)病理檢查證實(shí)為48例肺癌患者作為肺癌組。所有患者采取手術(shù)切除治療且術(shù)前未經(jīng)任何形式的放化療治療，男性25例，女性23例；年齡38～76歲，平均年齡(52.68±12.41)歲；根據(jù)2009年UICC肺癌TNM分期[9]，Ⅰ期12例，Ⅱ期19例，Ⅲ期17例；病理類型：腺癌26例，鱗癌22例；分化程度：低分化18例，中分化20例，高分化10例。納入同時(shí)期來我院行健康體檢的志愿者20例作為對照組，男性11例，女性9例；年齡39～72歲，平均年齡(53.75±12.56)歲。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析兩組患者間性別、年齡等基線資料無顯著差異，具有可比性。

1.2方法

1.2.1組織中miR表達(dá)的檢測肺癌組患者取病理石蠟包片(肺癌組織和癌旁組織)，采用切片機(jī)將組織蠟塊進(jìn)行切片，厚度為10 μm/片，取4個(gè)切片，加入TRIzol提取總RNA。采用逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法，檢測組織中miR-21、miR-31、miR-155表達(dá)。逆轉(zhuǎn)錄程序：在去核酶PCR薄管中加入反應(yīng)物，充分混合3～5 s，70°C孵育5 min，迅速放入冰中冷卻，再加入其它反應(yīng)物充分混勻，短暫離心，42°C孵育90 min，70°C加熱10 min，冰終止反應(yīng)。擴(kuò)增基因片段：95℃預(yù)變性1min，95℃15 s、60℃20 s、70℃25 s，40個(gè)循環(huán)，然后95℃延伸反應(yīng)20 s。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)real time PCR的擴(kuò)增曲線和融解曲線，進(jìn)行PCR定量時(shí)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線等。以U6為上樣內(nèi)參照，相對基因定量用ΔCT=ΔCTmiR-n-CTU6，ΔCt值越大，表示miR-21、miR-31、miR-155表達(dá)量越低。

1.2.2血清中miR表達(dá)的檢測肺癌患者于術(shù)前，對照組受試者于體檢時(shí)分別空腹取靜脈血5 ml。分離血清，取血清1 ml，加入TRIzol提取總RNA。按照1.2.1方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)張基因片段，測定血清中miR-21、miR-31、miR-155表達(dá)量。

1.3觀察指標(biāo)

比較肺癌患者和健康志愿者間血清miR-21、miR-31、miR-155表達(dá)水平差異；比較肺癌組織中和癌旁組織中miR-21、miR-31、miR-155表達(dá)水平差異；比較不同病理類型肺癌患者血清和癌組織中miR-21、miR-31、miR-155表達(dá)水平差異。

對所有患者進(jìn)行跟蹤隨訪，比較生存期≤6個(gè)月與生存期為6～12個(gè)月的肺癌患者就診時(shí)肺癌組織和血清中miR-21、miR-31、miR-155表達(dá)水平。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1肺癌患者與健康志愿者間血清miR-21、miR-31、miR-155表達(dá)水平比較

研究結(jié)果顯示肺癌患者血清miR-21、miR-31、miR-155表達(dá)水平顯著高于健康志愿者，P<0.05，見表1。

表1肺癌患者與健康志愿者間血清miR-21、miR-31、

組別miR-21miR-31miR-155健康志愿者(n=20)1.24±0.320.53±0.390.74±0.36肺癌患者(n=48)8.96±1.361.25±0.472.16±0.85t,P6.728,<0.052.541,<0.053.165,<0.05

*為與對照組比較，P<0.05。

2.2肺癌組織中和癌旁組織中miR-21、miR-31、miR-155表達(dá)水平比較

研究結(jié)果顯示肺癌組織中miR-21、miR-31、miR-155表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，P<0.05，見表2。

表2肺癌組織中和癌旁組織中miR-21、miR-31、

組別 miR-21miR-31miR-155癌旁組織(n=48)3.97±1.151.56±0.672.09±1.71肺癌組織(n=48)12.68±3.655.32±2.177.82±3.21t,P7.642,<0.054.156,<0.054.453,<0.05

*為與對照組比較，P<0.05。

2.3肺癌患者血清中miR-21、miR-31、miR-155表達(dá)與其臨床病理特征、預(yù)后的聯(lián)系

根據(jù)肺癌患者血清中miR-21、miR-31、miR-155表達(dá)水平是否高于平均值，分別分為miR-21高表達(dá)組(ΔCT>8.96，27例)，miR-21低表達(dá)組(ΔCT≤8.96，21例)；miR-31高表達(dá)組(ΔCT>1.25，28例)，miR-31低表達(dá)組(ΔCT≤1.25，20例)；miR-155高表達(dá)組(ΔCT>2.16，25例)，miR-155低表達(dá)組(ΔCT≤2.16，23例)。

結(jié)果顯示：腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度和生存期miR-21、miR-31、miR-155高表達(dá)組和低表達(dá)組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而性別、年齡及病理類型在兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

3討論

microRNAs是一類廣泛存在于動(dòng)物和植物體內(nèi)的內(nèi)源性非蛋白質(zhì)編碼的小分子RNA，microRNAs只有17～22個(gè)核苷酸組成，通過與靶mRNA 3'端非翻譯區(qū)互補(bǔ)配對，在翻譯后水平調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。隨著科技水平的進(jìn)步，越來越多的microRNAs被發(fā)現(xiàn)，醫(yī)學(xué)界對其生物學(xué)功能也給予了熱點(diǎn)關(guān)注[10-11]。大量研究表明，microRNAs參與了細(xì)胞生命活動(dòng)，與機(jī)體的生長、發(fā)育、應(yīng)激反應(yīng)、癌變及凋亡密切相關(guān)[12]。

在癌癥發(fā)生過程中，microRNAs可作為致癌基因或抑癌基因，調(diào)控腫瘤的生長、凋亡。已有研究證明多種microRNAs可作為癌癥診斷和預(yù)后的判斷指標(biāo)。其中miR-7、miR-21、miR-31、miR-34、miR-143、miR-155、miR-221被發(fā)現(xiàn)與肺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，這些microRNAs在肺癌組織中的表達(dá)不同于正常組織。miR-21、miR-31、miR-155是研究較為廣泛的致癌microRNAs。miR-21通過調(diào)節(jié)Ras/MEK/ERK通路從而抑制凋亡基因表達(dá)[13]；miR-31 通過對靶基因PPP2R2A 和LATS2 的抑制而起抗凋亡作用[14]；miR-155則通過下調(diào)S0CS1基因促進(jìn)細(xì)胞增殖，阻斷細(xì)胞調(diào)亡蛋白酶3的活性發(fā)揮抗調(diào)亡作用[15]。

表3　肺癌患者血清中miR-21、miR-31、miR-155表達(dá)與其臨床病理特征的關(guān)系/例

本次研究選擇了致癌基因miR-21、miR-31、miR-155作為觀察指標(biāo)，對肺癌組織和癌旁正常組織中這些microRNAs的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示肺癌組織中miR-21、miR-31、miR-155表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，研究結(jié)果與前人報(bào)道的結(jié)果一致。另外不同于前人的研究，本文創(chuàng)新性地對肺癌患者血清中miR-21、miR-31、miR-155表達(dá)水平進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肺癌患者血清中miR-21、miR-31、miR-155表達(dá)水平顯著高于正常健康人群。結(jié)果提示血清中miR-21、miR-31、miR-155表達(dá)水平升高可作為肺癌的臨床診斷指標(biāo)。隨后我們又對血清miR-21、miR-31、miR-155高表達(dá)與肺癌患者的臨床病理特征、預(yù)后關(guān)系進(jìn)行了初步分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-21、miR-31、miR-155表達(dá)水平與腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度呈正相關(guān)，miR-21、miR-31、miR-155的高表達(dá)是肺癌患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因子。

我們認(rèn)為血清中microRNAs檢測相比于肺癌組織病理活檢具有更好的可操作性，血清microRNAs檢測可以作為肺癌初步診斷的指標(biāo)，用于輔助判斷肺癌的惡化程度和預(yù)測預(yù)后。

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(編輯：吳小紅)

Research about the Change of miR in Serum and Tissues of Lung Cancer

GONGXing.XiangyangHospital,HubeiUniversityofMedicine,Xiangyang,441000

【Abstract】ObjectiveTo analyze the change of miR in serum and tissues of lung cancer.Methods48 cases of lung cancer were lung cancer group,and 20 cases of healthy volunteers who took medical examination were the control group.The expression of miR-21,miR-31,miR-155 in serum and tissues were detected by RT-PCR,and the difference between the 2 groups were compared.ResultsThe serum expression of miR-21,miR-31,miR-155 in lung cancer group were higher than those of the control group,and the expression of miR-21,miR-31,miR-155 in lung cancer tissues were significantly higher than pericarcinoma tissues,allP<0.05.The higher the serum expression of miR-21,miR-31,miR-155,the higher the TNM staging and lymph node metastasis degree,the worse the prognosis,allP<0.05.ConclusionMiR-21,miR-31,miR-155 have high expression in serum and tissues in patients with lung cancer,the serum expression of microRNAs can be used in preliminary diagnosis of lung cancer,and in auxiliary judgment for the degree of deterioration and prediction of prognosis.

【Key words】Lung cancer；miR；Serum；Tissue

(收稿日期2014-11-24修回日期 2015-04-07)

中圖分類號(hào)：R734.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-5930(2015)05-0645-03

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2015.05.005