PKM2基因對CD44+肺癌干細胞增殖及耐藥性的影響

郭昌瑩　匡裕康　李桃生

作者單位:330029 江西省腫瘤醫院(郭昌瑩，匡裕康)；8528523 日本國立長崎大學干細胞研究室(李桃生)

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PKM2基因對CD44+肺癌干細胞增殖及耐藥性的影響

郭昌瑩匡裕康李桃生

作者單位:330029 江西省腫瘤醫院(郭昌瑩，匡裕康)；8528523 日本國立長崎大學干細胞研究室(李桃生)

【摘要】目的觀察轉染后CD44+肺癌干細胞內PKM2 基因的表達變化及其對CD44+肺癌干細胞增殖、耐藥性的影響。方法將A549肺癌細胞株繼代培養后，采取免疫磁珠細胞分選法，通過AutoMACS儀器，分選出CD44+細胞。實驗分為實驗組和對照組，將人工合成的針對PKM2 基因的siRNA 片段通過Lipofectamine 2000 轉染細胞，分別采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time quantitativePCR，qRT-PCR)和Western blot 法檢測各組細胞中PKM2 的mRNA和蛋白質的表達量，細胞免疫組化染色分析CD44及PKM2表達，并采用MTT法檢測各組細胞的增殖活力。藥性敏感性試驗：在培養基內添加不同濃度化療藥物DDP，并通過MTT assay測試細胞的生長及增殖速度。結果CD44+肺癌干細胞轉染PKM2 siRNA 后，CD44+肺癌干細胞中PKM2 mRNA及蛋白表達減弱(P<0.05)，細胞增殖能力減弱，抗腫瘤藥物耐藥性降低。結論PKM2對CD44+肺癌干細胞的增殖起促進作用，同時具有增強抗腫瘤藥物耐藥性的作用。

【關鍵詞】肺癌干細胞；PKM2；增殖；耐藥性

(ThePracticalJournalofCancer,2015,30:641～644)

丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)是糖酵解過程中的一個關鍵酶，它有4種同工酶分別是M1型、M2型、L型、R型。近年來，研究都集中在丙酮酸激酶M2(pyruvate kinase M2，PKM2)上，在腫瘤細胞中呈高表達并在腫瘤的發生過程中起重要的作用[1]。有研究在肺癌[2]、胃癌[3]、胰腺癌[4-5]和結、直腸癌[6]等多種腫瘤中PKM2 的表達明顯增高，并且促進腫瘤細胞的增殖。本研究通過RNA干擾技術檢測CD44+肺癌干細胞中PKM2 的表達，探討PKM2 在CD44+肺癌干細胞中的表達及其對增殖和耐藥性的影響。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株A549肺癌細胞株購自美國Invitrogen公司。

1.1.2主要儀器PCR 儀(Bio-Rad)、酶標儀(Bio-Rad)、Western blot 儀(Bio-Rad)，流式細胞儀(BD FACS Calibur System)，AutoMACS儀器(Miltenyi Biotec)。

1.1.3主要試劑DMEM培養基、胰蛋白酶、胎牛血清(FCS，美國Gibico公司)DMSO、Trizol試劑、opti-MEM、Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司)，CD44 Microbeads及CD44抗體(美國Miltenyi Biotec公司)，反轉錄試劑盒及SYBR Premix、蛋白定量試劑盒、PKM2兔抗人多克隆抗體(美國Cell Signal Technology公司)，β-actin(美國Santa Cruz公司)，Western blot 二抗試劑盒、四甲基偶氮唑鹽(MTT)，PKM2siRNA由美國Santa Cruz公司設計并合成，并同時合成帶熒光標記的陰性對照siRNA。PKM2干擾序列5-GCUGUGGCUCUAGACACUATT-3′;5′-UAGUGUCUAGAGCCACAGCTT-3′;陰性對照組干擾序5-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′;5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。PCR引物由美國Santa Cruz公司合成PKM2 forward，5-CACCTgTACCgTggCATCTTC-3′；PKM2 reverse：5-gTCAgCACAATgACCACATCTC-3′。β-actin forward：5′-TggCACCCAgCACAATgAA-3′；β-actin reverse：5-CTAAgTCATAgTCCgCCTAgAAgCA-3′。

1.2 方法

1.2.1細胞繼代培養按普通的細胞繼代培養方法實施(詳略)。

1.2.2免疫磁珠細胞分選法將細胞與鼠抗人CD44抗體反應，清洗后再與磁珠標記二次抗體(兔抗鼠免疫球蛋白抗體)反應，清洗后通過AutoMACS儀器，分選出CD44+細胞和CD44-陰性細胞。并用FITC熒光標記抗CD44抗體確認出其良好純度情況。

1.2.3細胞轉染轉染前24 h分別取CD44+細胞和CD44-陰性細胞約3.0×105個接種于六孔培養板內，培養于含5% FCS不含抗生素的DMEM培養液，次日觀察細胞密度約達70%～80%開始轉染。將Lipofectamine2000和PKM2 siRNA 按1∶4比例分別稀釋于400 μl的opti-MEM培養液中，5 min內混勻，室溫避光孵育20 min后加入六孔培養板內培養6 h后更換新鮮的含5%FCS不含抗生素的DMEM培養液，繼續培養至48 h，收集細胞分別進行qRT-PCR 和Western blot檢測。

1.2.4RNA提取按1×106個細胞分別加1 ml Trizol的量抽提細胞的總RNA，整個操作過程均在冰上進行，提取的RNA測OD值。

1.2.5qRT-PCR 檢測各組細胞mRNA表達量分別取2 μg總RNA、使用PKM2和內參β-actin的反轉錄引物進行逆轉錄反應，以獲得的cDNA為模板，進行qRT-PCR反應，每組設3個復孔。反應條件為95 ℃預變性3 min，后按95 ℃10 s、57 ℃30 s、65 ℃30 s 反應40個循環，并繪制溶解曲線，以標準曲線法來計算各組中的PKM2表達量比值。

1.2.6Western blot檢測各組蛋白表達提取細胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，以每孔100 μg上樣，經10%的SDS-PAGE凝膠進行電泳分離后，轉移蛋白至PVDF 膜上，將膜置于封閉液中封閉1 h，加入1∶800稀釋的PKM2一抗4 ℃孵育過夜，過夜后用洗膜液洗3次各10 min，加入二抗孵育30 min，洗膜液洗3次各10 min。化學發光試劑顯影直到紫色條帶顯出后用蒸餾水終止顯色，觀察結果。以β-actin 為內參照，計算灰度值比值，作為其蛋白相對表達量。

1.2.7細胞免疫組化染色分析CD44及PKM2表達轉染前24 h分別取CD44+細胞約3.0×105個接種于六孔培養板內，培養于含5%FCS不含抗生素的DMEM培養液，次日觀察細胞密度約達70%～80%開始轉染。將Lipofectamine2000和PKM2 siRNA按1∶4比例分別稀釋于400 μl的opti-MEM 培養液中，5 min內混勻，室溫避光孵育20 min后加入六孔培養板內培養6 h后更換新鮮的含5%FCS不含抗生素的DMEM培養液，繼續培養至48 h后，分別進行細胞免疫組化染色分析。

1.2.8MTT法檢測細胞活性轉染前24 h胰酶消化收集細胞，接種于96孔板(每組4 孔)，細胞密度為每孔3×104，轉染步驟如上所述，24 h后每孔加入MTT20 μl，37 ℃孵育4 h后，棄上清液，在每孔加入100 μl的DMSO，避光振蕩10 min，用酶標儀在470 nm波長處測定各孔吸光度值，計算各組的平均值，以間接反映各組活細胞數量。

1.2.9藥性敏感性試驗轉染前24 h胰酶消化收集細胞，接種于96孔板(每組4孔)，細胞密度為每孔3×104，轉染步驟如上所述，24 h后在培養基內添加濃度為0 μg/ml、1 μg/ml 、3 μg/ml 、5 μg/ml化療藥物DDP，24 h后每孔加入MTT20 μl，37 ℃孵育4 h后，棄上清液，在每孔加入100 μl的DMSO，避光振蕩10 min，用酶標儀在470 nm波長處測定各孔吸光度值，計算各組的平均值，以間接反映各組活細胞數量。

2結果

2.1免疫磁珠法分選出CD44+腫瘤干細胞

從A549細胞中分選出CD44+肺癌干細胞，并用FITC熒光標記抗CD44抗體確認出其良好純度。

2.2PKM2的轉染效率

細胞通過Lipofectamine2000 瞬時轉染PKM2 siRNA，分別于24 h、48 h、72 h在倒置熒光顯微鏡下觀察實驗組和陰性對照組，發現3個時間段幾乎所有轉染組細胞的胞質、胞核可以觀察到綠色熒光，也就是說使用綠色熒光素標記的干擾RNA轉染成功，證實PKM2 siRNA已轉入細胞并表達。

2.3細胞免疫組化染色分析CD44及PKM2表達

細胞免疫組化染色顯示：PKM2 蛋白表達水平明顯下降，CD44蛋白表達水平也呈不同程度下降。

2.4qRT-PCR 檢測PKM2 的表達

qRT-PCR 檢測顯示，對照組和實驗組細胞內的PKM2表達量分別為1.78和0.86。實驗組中PKM2 mRNA表達水平顯著降低，與對照組相比具有顯著統計學意義(P<0.05)，見圖1。

圖1　qRT-PCR檢測PKM2的表達

2.5Western blot檢測PKM2蛋白水平的表達

Western blot檢測顯示：實驗組PKM2蛋白表達水平明顯降低，與對照組相比具有顯著統計學意義(P<0.05)，見圖2 。

圖2　Western blot檢測PKM2蛋白水平的表達

2.6MTT法檢測細胞增殖變化

MTT法檢測細胞增殖水平顯示，CD44+肺癌干細胞PKM2被干擾后，細胞的增殖速度明顯減慢，在48 h實驗組OD值明顯低于對照組，差異有顯著統計學意義(P<0.05)，見圖3。

2.7藥性敏感性實驗

實驗組與對照組相比，CD44+肺癌干細胞PKM2被干擾后，抗腫瘤藥物耐藥性降低，OD值差異有顯著統計學意義(P<0.05)，見圖4。

圖3　MTT法檢測細胞轉染后48 h增殖能力

圖4　MTT法檢測細胞轉染后48 h增殖能力

3討論

一般認為腫瘤干細胞起源于正常的組織干細胞[7]，并保有正常組織干細胞的部分特性，包括生存于氧濃度相對低下的組織環境中。目前用于辨別腫瘤干細胞的表面標志物，例如CD44及CD133等，其實基本上都屬于常用的造血干細胞的表面標志物。其中CD44是糖基化的跨膜多肽鏈，作為細胞表面受體接受細胞外基質糖基化、透明質酸化信息的傳導。研究發現，CD44在部分肺癌細胞中表達陽性，并與肺癌的發生、發展和轉移密切相關，顯示了其作為肺癌干細胞標記物的妥當性[8]。盡管腫瘤干細胞具有部分正常組織干細胞的基本特性，與正常的組織干細胞不同，腫瘤干細胞缺乏自穩能力，導致無限制生長，同時對化療藥物及放射線照射具有很強的抵抗能力。其原因或許與腫瘤干細胞保有獨特的信號轉導途徑，缺乏負反饋調節機制等有關[9]，但有待于繼續研究證實。

腫瘤細胞生長過程中的一個重要特征是糖代謝異常[10]，正常細胞只有在缺氧的情況下才發生糖酵解，而腫瘤細胞無論氧氣是否充足都主要依賴糖酵解進行代謝供能，消耗大量葡萄糖并產生乳酸，此現象由德國生物學家Otto Warburg 所發現，故稱為Warburg效應[11]。研究進一步發現，腫瘤細胞優先進行糖酵解這一代謝現象，主要是因為腫瘤細胞選擇性地高表達糖酵解過程中的一個關鍵酶---丙酮酸激酶M2(pyruvate kinase type M2,PKM2)[12-13]。腫瘤細胞通過表達PKM2獲得了優先進行糖酵解的代謝特性，使其即使在氧含量和營養不足的環境下也得以生存，并獲取大量的能量用以維持自身的高度增殖和擴散。因此，許多最近的研究著手解明PKM2表達調控的分子機制，并試圖通過改變腫瘤細胞PKM2表達及代謝特性來找到腫瘤治療的新途徑[14]。近來，有學者研究發現PKM2 在人肺癌細胞、乳腺癌細胞、人胚腎細胞及結腸癌組織中的表達較正常組織細胞明顯增加[15]，應用RNA干擾技術沉默肺癌細胞中的PKM2 基因表達，導入同工酶PKM2，觀察糖代謝方面的變化，發現PKM2 表達是有氧糖酵解所必需的，這種代謝方式使腫瘤具有特異性的生長優勢。本實驗在細胞水平通過Lipofectamine 2000 和PKM2 siRNA形成的復合物成功瞬時轉染CD44+肺癌干細胞。干擾PKM2 表達后，轉染CD44+肺癌干細胞中PKM2 表達量在mRNA水平和蛋白水平均顯著降低，證明了干擾效果的同時也證實了PKM2 在轉染CD44+肺癌干細胞中呈高表達。本實驗發現在細胞水平通過Lipofectamine 2000 和PKM2 siRNA形成的復合物成功瞬時轉染CD44+肺癌干細胞。干擾PKM2 表達后，CD44+肺癌干細胞中CD44在蛋白水平的表達也有不同程度的降低。PKM2 在腫瘤細胞中高表達有多方面原因。現已證實，其中一方面是由于PKM2 酪氨酸位點磷酸化，使四聚體解離為二聚體，在腫瘤細胞中以磷酸化丙酮酸低親和力的二聚體形式優先大量表達PKM2，二聚體的PKM2 與磷酸烯醇丙酮酸親和力低，從而導致磷酸烯醇類物質的堆積，使1,6-二磷酸果糖降解為丙酮酸明顯減少，而DNA合成增加，促進腫瘤細胞的增殖[16]。

本研究證實了PKM2 在肺癌干細胞中高表達，促進腫瘤干細胞增殖，并且影響腫瘤干細胞的耐藥性，對腫瘤細胞的生長起到關鍵作用，有可能成為治療肺癌和其他特異性表達PKM2 的惡性腫瘤的潛在新靶點。

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(編輯：吳小紅)

Effect of pkm2 Gene on Proliferation and Drug Resistance in CD44+

Lung Cancer Stem Cells

GUOChangying,KUANGYukang,LITaosheng.JiangxiCancerHospital,Nanchang,330029

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression of PKM2 and its effect on the proliferation and drug resistance in CD44+lung cancer stem cells.MethodsLung cancer A549 cells were separated into CD44+cells and CD44+cells by the immunomagnetic beads method through AutoMACS instrument,and then the PKM2 siRNA was transfected into CD44+lung cancer stem cells by Lipofectamine 2000.The experimental group and the control group were included in the study.qRT-PCR and western blot were used to measure the PKM2 expression at mRNA and protein levels,respectively.The cell proliferation was assessed by MTT assay.Drug sensitivity test:different chemotherapy drugs solubility of DDP were added into the culture medium,and then the cell proliferation was assessed by MTT assay.ResultsPKM2 siRNA was transfected into CD44+lung cancer stem cells,the expression of PKM2 mRNA and protein in CD44+cells decreased significantly (P<0.05),cell proliferation ability decreased,and anti-tumor drug resistance was reduced in CD44+cells.ConclusionPKM2 plays an important role in promoting the proliferation of CD44+lung cancer stem cells and enhancing the anti-tumor drug resistance.

【Key words】Lung cancer stem cells;PKM2;Proliferation;Drug resistance

(收稿日期2015-01-23修回日期 2015-03-16)

中圖分類號：R73-36

文獻標識碼：A

文章編號：1001-5930(2015)05-0641-04

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2015.05.004