雙重PCR檢測沙門氏菌和變形桿菌方法的建立

郇 娟，戈紅雨，張成龍，韓雙羽，師 偉，王玉寶

（1.天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院感染性疾病研究所，天津300211；2.天津醫(yī)科大學總醫(yī)院感染科，天津300052）

論著

雙重PCR檢測沙門氏菌和變形桿菌方法的建立

郇 娟1，戈紅雨2，張成龍1，韓雙羽1，師 偉1，王玉寶1

（1.天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院感染性疾病研究所，天津300211；2.天津醫(yī)科大學總醫(yī)院感染科，天津300052）

目的：建立快速鑒定腹瀉患者糞便標本中沙門氏菌和變形桿菌的雙重聚合酶鏈式反應（PCR）方法。方法：針對沙門氏菌屬特異基因invA和變形桿菌屬特異基因tuf分別設計特異性引物，將天津某醫(yī)院腸道門診腹瀉患者糞便標本經(jīng)SS培養(yǎng)基分離培養(yǎng)后，對可疑菌株同時進行invA-tuf基因雙重PCR鑒定和生化鑒定，比較兩種方法結(jié)果的一致性；對沙門氏菌進一步行血清學分型。結(jié)果：雙重PCR和生化反應都各自鑒定得到沙門氏菌31株和變形桿菌62株，而且二者鑒定結(jié)果完全一致；31株沙門氏菌包括鼠傷寒、腸炎等常見血清型和格蘭扁、菲爾摩雷等罕見血清型，均能擴增出283 bp長度片段，62株變形桿菌包括48株奇異變形桿菌、8株普通變形桿菌、2株潘氏變形桿菌、4株產(chǎn)黏液變形桿菌，均能擴增出541bp長度片段。結(jié)論：invA-tuf基因雙重PCR方法能夠快速可靠地鑒定SS培養(yǎng)基上生長的沙門氏菌和變形桿菌。

沙門氏菌；變形桿菌；雙重PCR；生化反應

食源性疾病是全球重要的公共衛(wèi)生問題之一，對人類的健康危害已引起人們高度關注。自1996-2010年FoodNet數(shù)據(jù)報告顯示沙門氏菌已經(jīng)成為食源性細菌性致病菌所致死亡的首因[1]。變形桿菌也是導致食源性疾病的常見病原菌之一,其導致的食物中毒數(shù)量位居前列[2]。在選擇性分離培養(yǎng)沙門氏菌的SS培養(yǎng)基（Salmonella Shigella agar）上，變形桿菌亦可生長，而且菌落顏色、形態(tài)與沙門氏菌有相似之處，可致混淆。鑒定沙門氏菌屬的多價血清和因子血清能夠與少數(shù)變形桿菌發(fā)生交叉凝集，引起鑒定困難[3]。因此，需要進行繁瑣費時的完整生化反應鑒定才能將二者正確區(qū)分。invA和tuf分別是沙門氏菌屬和變形桿菌屬特異基因，本研究嘗試建立invA-tuf雙重PCR方法，期望能快速可靠地鑒別這兩種食源性病原菌。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 研究所用菌株均分離自2013年5月-10月我院腸道門診腹瀉患者糞便標本中。質(zhì)控菌株大腸桿菌 ATCC25922，銅綠假單胞菌ATCC27853，為本研究所保存。

1.2 主要儀器 PCR擴增儀（德國Eppendorf公司）、脈沖場凝膠電泳儀（美國BIO—RAD公司）、GelDoc XR凝膠成像系統(tǒng)（美國BlO－RAD公司）、DYY—6D型電泳儀（北京六一儀器廠）。

1.3 主要試劑 亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）為北京陸橋公司產(chǎn)品，SS瓊脂為杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品，API20E生化試劑條和0.85%NaCl為法國梅里埃公司產(chǎn)品，沙門氏菌診斷血清為泰國S&A公司產(chǎn)品。Premix Taq DNA聚合酶、DNA分子量標準DL-2000、電泳緩沖液均購自大連寶生物Takaba生物工程公司。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，invA和tuf基因引物序列分別選自參考文獻[4-5]，序列分別為：

invA-F CTGGCGGTGGGTTTTGTTGTCTTCTCTATT

invA-R AGTTTCTCCCCCTCTTCATGCGTTACCC

tuf-F AAATTGTTGAATTAGCAGAAGCA

tuf-R GCGATTGGGTGGATCAGTTC

引物擴增的目的基因invA片段長度大小為283 bp，擴增的tuf基因片段長度為541 bp。

1.4 菌株分離與培養(yǎng) 細菌培養(yǎng)分離與生化鑒定嚴格按《全國臨床檢驗操作規(guī)程》（第3版）操作。取適量腹瀉患者糞便標本用亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(SC)增菌，37℃增菌16 h后，取增菌培養(yǎng)液一環(huán)接種于SS培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜。

1.5 菌株的鑒定 挑取SS培養(yǎng)基上的中等大小、中心黑色的圓形菌落進行純培養(yǎng)，將純培養(yǎng)的菌落同時進行雙重PCR和生化鑒定。

1.5.1 雙重PCR鑒定 煮沸法提取菌株基因組DNA，反應體系為invA和tuf基因的上、下游引物各1μL，TaqDNA聚合酶12μL，模板DNA 1μL，加滅菌去離子水至25μL。反應條件：94℃預變性5 min后，進行如下循環(huán)30次：94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸40 s；終末延伸5min。反應結(jié)束后取5μL 1%瓊脂糖凝膠電泳，電壓120 V，電泳約30 min，以DNA標志物DL2000為參照，用凝膠成像儀成像觀察結(jié)果。大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853為陰性質(zhì)控菌株。隨機選取1株沙門氏菌1317和1株變形桿菌1224的擴增產(chǎn)物測序，將序列在GenBank進行同源性比對。

1.5.2 菌株的生化鑒定 挑取純培養(yǎng)后的單個菌落接種于API20E生化試劑條，于37℃培養(yǎng)20 h后觀察結(jié)果。

1.6 沙門氏菌的血清學鑒定 沙門氏菌的血清學鑒定步驟按照泰國S&A公司提供的沙門氏菌血清診斷操作步驟進行，依照沙門氏菌抗血清診斷附錄和沙門氏菌檢驗國家標準(GB/T4789.4-2010)，根據(jù)測定得到的抗原式確定沙門氏菌的血清型。

2 結(jié)果

2.1 雙重PCR鑒定結(jié)果 可疑菌落進行雙重PCR鑒定，有31株菌擴增出283 bp長度的片段，判定為沙門氏菌，隨機選取的沙門氏菌1317的擴增產(chǎn)物測序，與 Genbank中 invA基因序列一致性為100%；有62株菌擴增出541 bp長度的片段，判定為變形桿菌，隨機選取的變形桿菌1224的擴增產(chǎn)物測序，與Genbank中的tuf基因序列有99%的一致性。部分PCR結(jié)果如圖1所示。

圖1 部分沙門氏菌和變形桿菌雙重PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig 1 Electrophoresis resultsofPCR productsofpartial Salmonella and Proteus

2.2 生化鑒定結(jié)果 可疑菌落經(jīng)生化鑒定，有31株為沙門氏菌，與雙重PCR鑒定結(jié)果完全一致；有奇異變形桿菌48株、普通變形桿菌8株、潘氏變形桿菌2株、產(chǎn)黏液變形桿菌4株，共計變形桿菌62株，與雙重PCR鑒定結(jié)果完全一致。

2.3 沙門氏菌血清學鑒定結(jié)果 31株沙門氏菌血清分型共涉及5個血清群、11個血清型，具體見表1。

表1 沙門氏菌的血清型分布情況Tab 1 Distribution of serotypesof Salmonella

3 討論

目前食源性致病菌的檢測方法多種多樣，既有傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法，也有聚合酶鏈式反應、基因芯片等，各有利弊。例如，傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法中，沙門氏菌和變形桿菌在SS培養(yǎng)基上的菌落都可以呈現(xiàn)為圓形、扁薄、半透明，中間黑色，但是如果依靠人為主觀區(qū)分，可造成誤判。個別奇異變形桿菌與沙門氏菌具有共同的抗原，可以與沙門菌屬A-F多價血清、因子血清O19發(fā)生強凝集反應，增加了菌株鑒定困難。根據(jù)沙門氏菌檢驗國家標準(GB/ T4789.4-2010)，沙門氏菌的生化鑒定操作步驟多，大約需要2～4 d才能完成，并且不能與變形桿菌完全區(qū)分開來，故檢測沙門氏菌和變形桿菌采用生化鑒定方法時，應使用全套生化反應試劑，因而耗時費力，不利于協(xié)助臨床及時判斷病情。

沙門氏菌invA基因核苷酸序列高度保守，為屬特異性基因[6]，編碼吸附和侵襲上皮細胞的表面抗原。Rahn等[7]以其為靶基因用PCR方檢測沙門氏菌，檢出率為97%，所用的引物經(jīng)過不斷的優(yōu)化，目前檢出率可達100%。變形桿菌屬tuf基因也具有高保守性[8]，用于檢測變形桿菌效果良好[9]。本研究采用了invA-tuf雙重PCR方法，經(jīng)過與生化反應對比，二者鑒定結(jié)果完全一致,沒有發(fā)現(xiàn)PCR結(jié)果陰性的標本其生化鑒定結(jié)果陽性，而且PCR方法明顯節(jié)約時間。痢疾桿菌和致病性大腸桿菌等也是重要的食源性致病菌，其在SS培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)、大小、顏色與沙門氏菌、變形桿菌明顯不同，可以從培養(yǎng)基上區(qū)分開來，不會對PCR結(jié)果造成干擾。

本組沙門氏菌不僅有常見的鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、阿貢那沙門氏菌等血清型，還有格蘭扁、菲爾摩雷和奧里塔曼林沙門氏菌等國內(nèi)罕見報道的血清型，均可以擴增出283 bp的特異條帶。而本組變形桿菌包含了奇異、普通、潘氏、產(chǎn)黏液4個菌種，也都能擴增出541 bp的特異條帶。這進一步證實了本研究采用的靶基因有很好的敏感性和特異性，invA-tuf雙重PCR方法能夠快速可靠地區(qū)分和鑒定沙門氏菌和變形桿菌，對于盡早指導臨床診斷和治療有很好的幫助。

值得注意的是，極其微量的污染即有可能造成PCR擴增假陽性的產(chǎn)生，因此要有嚴格的質(zhì)量控制并且認真遵守操作規(guī)程。還有一些報道采用PCR方法對食品或糞便直接檢測病原菌，具有快速和靈敏的特點。但是考慮到抗菌藥物藥敏試驗以及基因分型等溯源需求，PCR方法尚不能完全取代傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法。

（感謝中國疾病預防控制中心腹瀉病室對本研究提供的支持和幫助）

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（2014-07-24收稿）

Establishment of double PCRmethod for detection of Salmonella and Proteus

HUAN Juan1，GEHong-yu2，ZHANGCheng-long1，HANShuang-yu1，SHIWei1，WANGYu-bao1
（1.Institute of Infection Disease，The Second Hospital，Tianjin Medical University,Tianjin 300211,China；2.Department of Infection Disease,GeneralHospital,Tianjin MedicalUniversity,Tianjin 300052，China）

Objective:To develop adouble PCR assay forsimultaneousidentification of Salmonella and Proteus isolated from stoolsamples ofpatientswith diarrhea.Methods:Based on the invA gene in Salmonella and the tuf gene in Proteus,2 pairsofprimerswere designed.The stoolsamplesofdiarrhea patients in the diarrhea outpatientclinic ofa hospital in Tianjin were collected for the culture on the Salmonella Shigella agar after which double PCR and biochemical identification were carried out simultaneously with the suspected colonies.The consistency of the two methods was evaluated.The serological typing was carried out for Salmonella.Results:Thirty-one strains of Salmonella and 62 strains of Proteus were detected by double PCR and biochemical identification respectively,and the results were identical for the twomethods.The 31 strainsof Salmonella included both the common serotypes(e.g.S.Typhimurim and S.Enteritidis）and rare serotypes（e.g.S.Grampian and S.Fillmore）.283 bp and 541 bp fragmentswereobtained forall Salmonella and 62 strainsof Proteus(48 P.mirabilis，8 P.vulgaris，2 P.penneriand 4 P.myxofaciens)，respectively.Conclusion:The invA-tuf double PCR assay couldmake rapid and reliable identification of the Salmonella.spp and Proteus.spp isolated on the Salmonella Shigella agar.

Salmonella；Proteus；double PCR；biochemical tests

R372

A

1006－8147（2015）01-0084-03

天津市衛(wèi)生局科研基金資助項目（2013KZ112)

郇娟（1988-），女，碩士在讀，研究方向：細菌耐藥及致病機制；通信作者：王玉寶，E-mail：wyb2046@163.com。