HB-H-6樹脂的血液相容性研究

吳 迪，田帥帥，李依宸，郭紅星，李 濤

（1.天津醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，天津300070；2.天津市第三中心醫(yī)院肝膽疾病研究所，天津300170）

論著

HB-H-6樹脂的血液相容性研究

吳 迪1，田帥帥1，李依宸2，郭紅星2，李 濤2

（1.天津醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，天津300070；2.天津市第三中心醫(yī)院肝膽疾病研究所，天津300170）

目的：用白蛋白預(yù)充技術(shù)改善HB-H-6樹脂的血液相容性。方法：實(shí)驗(yàn)分為兩部分，首先用HB-H-6樹脂對血漿和全血進(jìn)行體外動(dòng)靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)，對比二者之間共有成分之間的差異；然后用白蛋白預(yù)充后的HB-H-6樹脂和未預(yù)充的HB-H-6樹脂對全血進(jìn)行體外動(dòng)靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)，對比未預(yù)充組與預(yù)充組血細(xì)胞與血小板的變化情況。結(jié)果：（1）血漿未預(yù)充組和全血未預(yù)充組的動(dòng)靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，未經(jīng)處理的HB-H-6樹脂對血漿和全血之間共有成分的吸附效果基本一致，灌流前后僅部分電解質(zhì)有所變化。（2）動(dòng)靜態(tài)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，全血預(yù)充組中白細(xì)胞、紅細(xì)胞和血小板的吸附率較全血未預(yù)充組均明顯改善。結(jié)論：白蛋白預(yù)充技術(shù)改善了HB-H-6樹脂的血液相容性，為臨床上直接進(jìn)行全血灌流提供了理論基礎(chǔ)。

HB-H-6樹脂；血液灌流；血液相容性；白蛋白

隨著醫(yī)學(xué)、化學(xué)、生物醫(yī)學(xué)工程等領(lǐng)域的發(fā)展，血液灌流領(lǐng)域涌現(xiàn)出了許多人工合成的新材料，比如離子交換樹脂、大孔吸附樹脂等[1]。但大多數(shù)這些合成材料本身并不具備很優(yōu)異的血液相容性，隨著在臨床中投入使用，材料血液相容性方面的一些弊端也逐漸顯現(xiàn)[2]。近年有學(xué)者報(bào)道利用白蛋白包裹大孔吸附樹脂為大孔吸附樹脂提供了良好的生物相容性，并保持了對膽紅素、血氨、膽汁酸等的吸附性[3-4]。包裹白蛋白對于實(shí)驗(yàn)來說很容易，但是對于樹脂的產(chǎn)業(yè)化來說，卻需要繁瑣復(fù)雜的技術(shù)手段及苛刻的技術(shù)條件，大批量生產(chǎn)不太現(xiàn)實(shí)。目前臨床上對高膽紅素血癥患者均采用血漿灌流進(jìn)行治療，還未有人直接采用全血進(jìn)行灌流，本研究通過對比研究白蛋白預(yù)充組HB-H-6樹脂和未預(yù)充組HBH-6樹脂在進(jìn)行體外動(dòng)靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)過程中血細(xì)胞和血小板的變化，期望白蛋白預(yù)充能為樹脂提供良好的血液相容性，從而去掉臨床上血漿分離的步驟，為患者在臨床上直接進(jìn)行全血灌流提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器 HB-H-6樹脂由天津市紫波高科技有限公司提供；5%的250mL人血清白蛋白(Baxter Healthcare Corporation)；寧波甬星醫(yī)療儀器智能輸液泵；HZS-H型水浴恒溫振蕩器（哈爾濱東聯(lián)有限公司）；新鮮正常人全血與血漿；自制灌流吸附柱(由輸血器改裝)；TBA 120-RF全自動(dòng)生化分析儀（日本TOSHIBA公司）；NOVACRT-16電解質(zhì)分析儀(美國NOVA公司)；NaOH（分析純）；HCl（分析純）；無水乙醇（分析純）

1.2 HB-H-6樹脂的處理 將樹脂用無水乙醇淋洗72 h，用注射用水淋洗至中性；然后以5%NaOH淋洗24 h，用注射用水淋洗至中性；再以5%HCl淋洗24 h，用注射用水淋洗至中性；最后121℃高壓蒸汽滅菌20min，浸泡于生理鹽水保存。

1.3 體外靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確量取30份HB-H-6樹脂，將樹脂分為血漿未預(yù)充組、全血未預(yù)充組和全血預(yù)充組，每組10份，每份1mL。將血漿未預(yù)充組和全血未預(yù)充組樹脂分別放入10mL血漿和10 mL全血中 (樹脂和正常人全血/血漿按體積比1：10比例混合)，然后置37℃恒溫水浴振蕩2 h，振蕩前后測定蛋白質(zhì)、電解質(zhì)和血細(xì)胞及血小板濃度。將全血預(yù)充組樹脂在實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行白蛋白預(yù)充1 h，然后放入10mL全血中，置37℃恒溫水浴振蕩2 h，振蕩前后測定血細(xì)胞及血小板濃度。

1.4 體外動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn) 模仿血液循環(huán)過程，體外動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)采用循環(huán)吸附模式，如圖1。準(zhǔn)確量取30份HB-H-6樹脂，將樹脂同樣分為血漿未預(yù)充組、全血未預(yù)充組和全血預(yù)充組，每組10份，每份3 mL裝入各吸附柱中，將血漿未預(yù)充組和全血未預(yù)充組樹脂分別連接30mL血漿和30mL全血 (樹脂和正常人全血/血漿按體積比1：10比例混合)，然后在循環(huán)速度為4mL/min下，體外循環(huán)動(dòng)態(tài)吸附2 h，分別在0、30、60、120min取樣測定蛋白質(zhì)、電解質(zhì)和血細(xì)胞及血小板濃度。將全血預(yù)充組樹脂先連接白蛋白預(yù)充1 h，然后連接30mL全血重復(fù)以上步驟，取樣測定血細(xì)胞及血小板濃度。

圖1 體外動(dòng)態(tài)吸附示意圖Fig 1 Schem atic diagram of dynam ic adsorption experim ent in vitro

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件處理，數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)檢驗(yàn)，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用方差分析對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，對方差齊性的數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)，對方差不齊性的數(shù)據(jù)采用t′檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 血漿未預(yù)充組和全血未預(yù)充組動(dòng)靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

2.1.1 血漿未預(yù)充組和全血未預(yù)充組靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

2.1.1.1 蛋白質(zhì)和補(bǔ)體的變化情況：從表1和表2可以看出，血漿未預(yù)充組和全血未預(yù)充組中的蛋白質(zhì)進(jìn)行靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)前后無明顯變化（P＞0.05），補(bǔ)體C3、C4有一定的改變，但不明顯（P＞0.05），且均在正常值范圍內(nèi)。

表1 血漿未預(yù)充組進(jìn)行靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)前后蛋白質(zhì)和補(bǔ)體的濃度（n＝10）Tab 1 Theconcentrationsof protein and complement in theplasma unprefilled group before and after the static adsorption experim ent(n=10)

表2 全血未預(yù)充組進(jìn)行靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)前后蛋白質(zhì)和補(bǔ)體的濃度(n=10)Tab 2 The concentrations of p rotein and comp lem ent in the whole blood unprefilled group before and after the static adsorption experim ent(n=10)

2.1.1.2 電解質(zhì)的變化情況：由表3和表4可以看出血漿未預(yù)充組和全血未預(yù)充組電解質(zhì)P、K、Na、Cl前后均無明顯變化（P＞0.05），血漿未預(yù)充組Ca和Mg分別下降了22.19%，57.6%（P＜0.05），全血未預(yù)充組Ca和Mg分別下降了24.38%，63.33%（P＜0.05）。

表3 血漿未預(yù)充組進(jìn)行靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)前后電解質(zhì)的濃度(n=10)Tab3 The concentrations of electrolyte in the plasm a unp refilled group beforeand after thestaticadsorption experiment(n=10 )

表4 全血未預(yù)充組進(jìn)行靜態(tài)吸附試驗(yàn)前后電解質(zhì)的濃度(n=10)Tab 4 The concentrations of electrolyte in thewhole blood unprefilled group beforeand after thestatic adsorption experiment (n=10)

2.1.2 血漿未預(yù)充組和全血未預(yù)充組動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)的結(jié)果 表5和表6描述了體外動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，從表5和表6可以看出在灌流結(jié)束時(shí)，血漿未預(yù)充組和全血未預(yù)充組中的蛋白質(zhì)均無明顯變化（P>0.05）；補(bǔ)體C3、C4有一定的改變，但變化不明顯（P＞0．05），且均在正常值范圍內(nèi)；P、K、Na、Ca、Cl前后無明顯變化（P>0.05），電解質(zhì)Mg變化明顯（P＜0．05），血漿未預(yù)充組Mg下降了50.7%（P< 0.05），全血未預(yù)充組Mg下降了48.7%（P<0.05）；在30、60、120min時(shí)間點(diǎn)，進(jìn)吸附柱前和出吸附柱后血漿未預(yù)充組和全血未預(yù)充組各項(xiàng)指標(biāo)均無明顯變化（P>0.05）。

表5 血漿未預(yù)充組進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)各時(shí)間段各項(xiàng)指標(biāo)的濃度(n=10)Tab 5 The concentration of each index ateach time segment in the plasm a unp refilled group in the dynam ic adsorption experim ent(n=10)

表6 全血未預(yù)充組進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)各時(shí)間段各項(xiàng)指標(biāo)的濃度(n=10)Tab 6 The concentration ofeach index ateach time segment in thewholeblood unprefilled group in the dynam icadsorption experiment(n=10)

2.2 全血未預(yù)充組和全血預(yù)充組動(dòng)靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

2.2.1 全血未預(yù)充組和全血預(yù)充組靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)的結(jié)果 從表7和表8可以看到，全血未預(yù)充組在吸附2 h后白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板分別下降了約

11.14 %、2.75%、28.9%。全血預(yù)充組結(jié)果明顯優(yōu)于未預(yù)充組，白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板分別下降了約5.1%、1.8%、10.3%。

2.2.2 全血未預(yù)充組和全血預(yù)充組動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)的結(jié)果 在吸附30、60、120min后，全血預(yù)充組對體系中白細(xì)胞的吸附率、紅細(xì)胞的吸附率、血小板的吸附率較全血未預(yù)充組對體系中白細(xì)胞的吸附率、紅細(xì)胞的吸附率、血小板的吸附率均有明顯改善。而且在30、60、120min時(shí)間點(diǎn)，全血預(yù)充組在進(jìn)吸附柱前到出吸附柱后對白細(xì)胞的吸附率、紅細(xì)胞的吸附率、血小板的吸附率較全血未預(yù)充組在進(jìn)吸附柱前到出吸附柱后對白細(xì)胞的吸附率、紅細(xì)胞的吸附率、血小板的吸附率也均有明顯的降低。見圖2～4。

表7 全血未預(yù)充組進(jìn)行靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)前后血細(xì)胞及血小板的濃度(n=10)Tab 7 The concentrations of blood cells and platelets in the whole blood unp refilled group before and after the static adsorption experiment(n=10)

表8 全血預(yù)充組進(jìn)行靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)前后血細(xì)胞及血小板的濃度(n=10)Tab 8 The concentrations of blood cells and p latelets in the whole blood prefilled group before and after the static adsorption experiment(n=10)

圖3 體系血液中(左)及進(jìn)吸附柱前和出吸附柱后(右)紅細(xì)胞的吸附率隨時(shí)間變化情況Fig 3 The variation with time on adsorption rate of red blood cells in thesystem(left)and through theadsorption column(right)

圖4 體系血液中(左)及進(jìn)吸附柱前和出吸附柱后(右)血小板的吸附率隨時(shí)間變化情況Fig 4 The variation with time on adsorption rate of platelets in the system(left)and through theadsorption column(right)

3 討論

對血液灌流最初的探索是在20世紀(jì)中期，研究主要集中在對內(nèi)源性和外源性毒物的吸附作用[5-6]，而忽略了血液相容性引起的一系列問題（血小板減少、溶血反應(yīng)、致熱原反應(yīng)、微粒栓塞等）。1970年華裔加拿大籍學(xué)者張明瑞教授首創(chuàng)用火膠棉白蛋白包裹活性炭的方法取得成功[7]，提高了活性炭的血液相容性。近些年也有國內(nèi)學(xué)者用白蛋白包裹樹脂來提高其生物相容性的報(bào)道[8]，于志遠(yuǎn)等[3]研究了固定牛血清蛋白的大孔樹脂對膽紅素的吸附性能，結(jié)果顯示所得到新型樹脂具有良好的血液相容性，且具有對膽紅素特異性吸附的性能。但是其研究所需要的包膜條件（如室溫?cái)嚢?4 h等），使樹脂很難能大批量生產(chǎn)。而且雖然前人的研究都提到白蛋白包裹樹脂提高了血液相容性，但是報(bào)告均側(cè)重于對毒素的吸附效果進(jìn)行研究，并未有人對血液相容性進(jìn)行系統(tǒng)的研究。所以本研究采用白蛋白預(yù)充技術(shù)，在不影響樹脂的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的前提下，對樹脂的血液相容性進(jìn)行改進(jìn)，并作出了系統(tǒng)的血液相容性研究。

HB-H-6樹脂是一種大孔陰離子交換樹脂，由于其對低密度脂蛋白具有良好的吸附特異性[9-10]，目前已廣泛應(yīng)用于治療黃疸[11]并取得良好療效。近些年隨著對其不斷的研究，在其他疾病方面也有不錯(cuò)的效果，如銀屑病[12]等，但在血液相容性方面卻一直沒有太大的進(jìn)展。臨床上仍采用血漿灌流對患者進(jìn)行救治[13-14]，這樣雖避免了血液中的有形成分與吸附材料的直接接觸，但是血漿分離的高成本卻大大加大了患者醫(yī)治的費(fèi)用。本研究旨在提高樹脂血液相容性，去掉血漿分離步驟直接進(jìn)行全血灌流，節(jié)省成本，便于臨床開展。

首先對比第一部分的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出，未經(jīng)處理的HB-H-6樹脂對血漿和全血之間共有成分（如電解質(zhì)、蛋白質(zhì)等）的吸附效果基本一致，那么決定能否去除血漿分離步驟，直接進(jìn)行血液灌流的關(guān)鍵因素就集中在了HB-H-6樹脂對血細(xì)胞以及血小板的影響上。

從靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)中我們可以看出，全血未預(yù)充組中有形成分變化明顯，尤其是血小板，下降了28.9%；而全血預(yù)充組結(jié)果明顯優(yōu)于全血未預(yù)充組，對血小板的吸附率更是從28.9%下降到了10.3%。對于動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)方面，從動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)的示意圖（圖1）可以看見，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了兩個(gè)取樣點(diǎn)，分別是吸附柱前和吸附柱后。這樣取樣不僅能看到體系中（即吸附柱前）各項(xiàng)指標(biāo)的變化情況，也可以看到進(jìn)吸附柱前和出吸附柱后的變化情況。從圖2～4中可以看到白細(xì)胞、紅細(xì)胞和血小板，無論是體系血液長時(shí)間灌流后的吸附率還是在各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)吸附柱后的吸附率，全血預(yù)充組的吸附率曲線都要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于未預(yù)充組，尤其是血小板。體系中，未預(yù)充組的血小板在動(dòng)態(tài)吸附2 h后下降了55.2%，而預(yù)充組動(dòng)態(tài)吸附2 h后僅下降了12.2%；在30、60、120min時(shí)間點(diǎn)，進(jìn)吸附柱后，未預(yù)充樹脂對血小板的吸附率分別從13.9%、24.3%、14.9%下降到了預(yù)充后的3.1%、5.4%、3%。可以看出未預(yù)充樹脂對血小板有嚴(yán)重影響，而經(jīng)預(yù)充后的樹脂對血小板的影響明顯減小。所以利用白蛋白預(yù)充技術(shù)提高HB-H-6樹脂的血液相容性是可行的，為臨床上直接進(jìn)行全血灌流提供了理論基礎(chǔ)。

本研究選擇體外實(shí)驗(yàn)作為血液相容性材料的初步篩選實(shí)驗(yàn)，雖然其有快速、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)[15]，但是血液相容性的研究歸根結(jié)底是要研究血液與材料接觸時(shí)體內(nèi)血液的情況，對HB-H-6血液相容性的改善能否在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也得到體現(xiàn)是需要進(jìn)一步研究的問題。

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(2014-07-11收稿)

Study on blood com patibility of HB-H-6 resin

WUDi1,TIANShuai-shuai1,LIYi-chen2,GUOHong-xing2,LITao2
(1.School of Biomedical Engineering,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China;2.Hepatobiliary Disease Institute,The Third CentralHospitalof Tianjin,Tianjin 300170,China)

Objective：To improve the blood compatibility of HB-H-6 resin using prefilling the albumin.Methods:Dynamic and static adsorption experiments in vitro on plasma and whole blood with HB-H-6 resin were carried out,and the difference between the common compositionsofplasmaandwholebloodwereanalyzed.Dynamic and static adsorption experiments in vitro on plasmaandwholebloodwere carried outwith the prefilled HB-H-6 resin be prefilled albumin and theunprefilled HB-H-6 resin,and the changesof theblood cellsand plateletsin the prefilled group and theunprefilled groupwereanalyzed.Results:(1)The resultofstatic and dynamic adsorption experiments in the prefilled group and theunprefilled group showed that the HB-H-6 resin untreated had the same theadsorption effecton the common compositionofplasmaandwholeblood.After theperfusion,theproteinand C3,C4 did notchangesignificantly(P>0.05),and onlypartof the electrolyte changed.(2)The resultofstatic and dynamic adsorption experimentshowed,the adsorption ratesofwhite blood cells,red blood cellsand platelets in the prefilled group was lower than those in the unprefilled group.Conclusion:Prefilling the albumin improves the blood compatibility ofHB-H-6 resin,providesa theoreticalbasis forwholeblood perfusion in clinic.

HB-H-6 resin;hemoperfusion;blood compatibility;albumin

R318.08

A

1006－8147（2015）01-0075-05

天津市科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目基金資助（122CZDSY02700）；天津“小巨人”項(xiàng)目（2010-BK130012）；天津市科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新基金（122XCXSY04400）；天津市衛(wèi)生局重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目（2013-GG-03）；天津市衛(wèi)生局重點(diǎn)課題（10KG105）

吳迪（1988-），男，碩士在讀，研究方向：生物醫(yī)學(xué)工程；通信作者：李濤，E-mail：litao0387@sohu.com。