氨肽酶N在乳腺癌血管生成中的作用及其與VEGF的相關性

曹文慶，寧殿賓，馮 麗，趙玉哲，張 靜

（河北省人民醫院普外一科，石家莊050051）

論著

氨肽酶N在乳腺癌血管生成中的作用及其與VEGF的相關性

曹文慶，寧殿賓，馮 麗，趙玉哲，張 靜

（河北省人民醫院普外一科，石家莊050051）

目的：研究氨肽酶N（APN）在乳腺癌的表達及臨床意義，比較其與血管內皮生長因子（VEGF）的關系，探討APN在乳腺癌血管生成中的作用。方法：采用免疫組織化學SP法檢測APN在60例乳腺癌組織、20例癌旁正常乳腺組織中的表達。結果：APN主要表達于腫瘤細胞的細胞膜，APN在乳腺癌上的表達率[36.7%（22/60）]明顯高于癌旁正常乳腺組織[0%（0/20）]（χ2=10.115，P= 0.001）；APN在乳腺癌上的表達與病理類型有關（P=0.035）。乳腺癌組織內還可見新生血管內皮著色，而癌旁正常組織血管內皮無著色；相關性分析顯示，乳腺癌組織APN與VEGF的表達無直線相關關系（rs=0.078，P=0.553），但VEGF陽性組APN表達率[44.7%（21/47）]高于VEGF陰性組[7.7%（1/13）]（χ2=4.512，P=0.034）。結論：APN與VEGF在乳腺癌血管發生中可能存在一定的協同作用，乳腺癌中APN的表達可提示預后不良，APN可以作為抗腫瘤血管藥物中有力的靶點。

氨肽酶N/CD13；免疫組織化學；乳腺腫瘤；血管內皮生長因子

氨肽酶N（aminopeptidase N，APN）是一種能從肽鏈氨基端催化降解氨基酸殘基的水解蛋白酶。1989年Look等[1]通過互補DNA克隆序列對比發現APN與CD13為同一蛋白。多年來APN/CD13主要作為髓系造血干細胞表面的標志物而應用于白血病或者淋巴瘤的分型，近年來卻相繼報道，其在肺癌、卵巢癌和肝癌等多種癌細胞表面高水平表達，在體內參與腫瘤的血管發生。Gao等[2]研究發現APN抑制劑能顯著降低小鼠卵巢癌移植瘤的微血管密度；Bhagwat等[3]研究發現，在腫瘤微環境中，缺氧、血管內皮生長因子（VEGF）等血管生長信號均可誘導新生血管內皮APNmRNA的表達。本實驗應用免疫組織化學SP法，檢測APN在乳腺癌組織上的表達情況，分析其與乳腺癌臨床病理特征之間的關系；并通過比較APN表達與VEGF的關系，探討APN在乳腺癌血管發生中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 收集河北省人民醫院病理科2011年7月-2012年9月經手術切除、病理證實的乳腺癌石蠟標本60例，癌旁正常乳腺組織石蠟標本20例。所有乳腺癌患者均為女性，年齡28～72歲，中位年齡51.5歲，術前均未行放、化療或其他針對腫瘤的治療；無其他腫瘤病史。

1.2 主要試劑 鼠抗人CD13單克隆抗體、SP免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 實驗方法 采用免疫組織化學SP法檢測APN在乳腺癌及癌旁正常組織上的表達情況。用PBS代替一抗作為陰性對照，用預實驗陽性片做陽性對照。步驟：（1）所有石蠟包埋標本做4μm厚組織切片，置于60℃隔水式培養箱內烤片2 h；（2）經二甲苯、梯度酒精脫蠟，自來水沖洗、浸泡水化；（3）應用檸檬酸鹽抗原修復液進行高壓熱修復；（4）冷卻后滴加3%H2O2去離子水，室溫下孵育10min，PBS沖洗；（5）滴加50μL山羊血清工作液，室溫下孵育10 min，PBS沖洗；（6）滴加50μL一抗，置于濕盒中孵育，4℃冰箱過夜；（7）取出過夜的切片，室溫下復溫20min，PBS沖洗；（8）滴加50μL二抗，濕盒內室溫孵育1 h，PBS沖洗；（9）滴加50μL辣根酶，濕盒內室溫孵育45min，PBS沖洗；（10）滴加DAB顯色，在光學顯微鏡下邊觀察邊顯色，觀察1～15min，達最佳效果后，蒸餾水沖洗終止反應；（11）蘇木素液中復染1min，自來水沖洗10 s；（12）1%鹽酸酒精分化5 s，自來水沖洗；（13）梯度酒精脫水，自然風干；（14）中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察結果。

1.4 結果判定 APN陽性判斷標準：在高倍鏡下（400×）計數400個腫瘤細胞，按陽性細胞百分比評分：＜10%為1分；11%～50%為2分；51%～75%為3分；＞75%為4分。按陽性著色程度評分：0分為無著色，1分為淺黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。兩者乘積判定陽性結果：1～3分為陰性（-）；4～5分為弱陽性（+）；6～7分為中陽性（++）；≥8分為強陽性（+++）。以“-”者為陰性，以“+、++、+++”者為陽性。閱片采用雙盲法，每張切片均由2名病理醫師判讀。1.5 統計學分析 應用SPSS 13.0統計軟件對結果進行統計處理，統計方法采用χ2檢驗及spearman等級相關分析，以P＜0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 APN在乳腺癌組織及癌旁組織上的表達情況

APN主要表達于腫瘤細胞，定位于細胞膜，少許細胞漿著色，多呈淺黃色或棕黃色。僅少數患者（6.7%）APN表達于間質細胞。另外可見癌組織導管上皮基底膜和新生血管內皮著色，癌旁正常組織僅見導管上皮基底膜著色，血管內皮未見著色（圖1，2）。

圖1 乳腺癌組織APN陽性表達（SP×200）Fig 1 Positiveexpression of APN in breast cancer tissues（SP×200）

圖2 乳腺癌旁正常組織APN陰性表達(SP×200)Fig 2 Negativeexpression of APN in norm albreast tissues（SP×200）

檢測乳腺癌石蠟標本共60例，“-”38例，“+”8例，“++”5例，“+++”9例，APN在乳腺癌上的陽性表達率為36.7%（22/60），癌旁正常乳腺組織未見APN表達（0/20）。APN在乳腺癌上的表達率顯著高于癌旁正常乳腺組織（χ2=10.115，P=0.001）。

2.2 APN的表達與乳腺癌臨床病理特征之間的關系 APN在乳腺癌組織的表達情況與病理類型有關，APN在浸潤性導管癌組的陽性表達率為45.2%（19/42），高于其它病理類型組陽性表達率16.7%（3/ 18）（χ2=4.429，P=0.035）。而APN的表達與絕經狀況、腫瘤大小、臨床分期、組織學分級、淋巴結轉移狀態無關（P＞0.05），與ER、PR、Her-2指標無關（P＞0.05）。見表1。

2.3 乳腺癌組織中APN與VEGF的關系 60例乳腺癌患者VEGF的表達，“-”13例，“+”7例，“++”13例，“+++”27例，VEGF陽性表達率78.3%（47/60）。相關性分析顯示，APN與VEGF在乳腺癌組織的表達無直線相關關系（rs=0.078，P=0.553）。VEGF陽性組與VEGF陰性組APN陽性表達率分別為44.7%（21/47）、7.7%（1/13），結果顯示，VEGF陽性組APN陽性表達率高于VEGF陰性組（χ2=4.512，P=0.034）。

表1 60例乳腺癌APN表達與臨床病理參數之間的關系Tab 1 Relationship between the expression of APN and clinicopathologicalparam eters in breast cancer

3 討論

目前我國乳腺癌發病率呈上升趨勢，且發病年齡趨于年輕化。現如今對于乳腺癌綜合治療的理念已日臻成熟，但是仍有部分患者治療失敗出現復發轉移。因此，探討乳腺癌復發轉移的機制，尋找參與乳腺癌復發轉移的基因,是目前國內外研究的熱點之一。

人APN基因定位于染色體15q25-26，全長35 kb，基因編碼序列包含20個外顯子，其表達受近端和遠端兩個啟動子調節，在上皮細胞，由近端啟動子啟動轉錄；在髓細胞及成纖維細胞，由遠端啟動子啟動轉錄。APN蛋白屬于結合鋅離子的金屬蛋白酶超家族，分子量150 kD左右，由967個氨基酸組成，通過氨基端跨膜螺旋區錨在細胞膜上，能夠從肽、酰胺或芳酰胺上水解釋放N端的中性氨基酸。研究發現，APN在腫瘤的信號轉導、免疫調節、侵襲轉移與血管生成等方面都發揮著重要作用，以APN為靶點的靶向性抗腫瘤藥物也成為了抗癌藥物開發的新領域。

APN參與降解細胞外基質，這種酶在腫瘤細胞上的表達可以增強細胞運動性，加快腫瘤擴散和轉移[4]。近幾年來關于APN在實體瘤方面的臨床研究相繼開展，涉及乳腺癌、肺癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤疾病[5-7]。本研究發現APN主要表達于腫瘤細胞，定位于細胞膜，這可能與APN定位于細胞膜的分子結構有關。APN在乳腺癌上表達率為36.7%，這與Ranogajec等[5]（36.2%，50/138）報道的數據較為一致。本研究還證實，APN在乳腺癌組織上的陽性表達高于癌旁正常乳腺組織。

乳腺癌病理類型較多，預后差別大。常用的預測因子，包括疾病的臨床分期、腫瘤大小、淋巴結轉移情況、組織學分級、ER、PR和Her-2蛋白表達情況等。本研究分析了APN的表達情況與乳腺癌預后因子的關系，發現在乳腺癌上APN多表達于浸潤性導管癌，而APN表達情況與淋巴結轉移狀態無關。Ranogajec等[5]發現乳腺癌上APN表達與淋巴結狀態無相關性，但淋巴結陽性組APN在乳腺癌上的表達更強。有關肺癌的研究發現,鱗癌組織APN的表達與淋巴結狀態有顯著相關性，而腺癌組織APN的表達與淋巴結狀態無相關性,認為其原因可能由于鱗癌組織APN主要表達于腫瘤間質細胞，累及成纖維細胞和血管內皮細胞，更有利于腫瘤的侵襲、轉移，所以與淋巴結狀態有顯著相關性，而腺癌組織APN主要表達于腫瘤實質細胞，間質表達缺乏，所以與淋巴結狀態無相關性。我們的研究顯示，乳腺癌上APN主要表達腫瘤細胞，間質細胞表達缺乏，所以，APN在乳腺癌上表達情況與淋巴結狀態的關系還需進一步研究。另外，APN表達情況與乳腺癌其它預后因子無關。還有研究發現乳腺癌APN的表達與總生存時間呈負相關趨勢，類似的結果在其他腫瘤上也有發現，如胰腺癌、肺癌等[6-7]。提示APN可以作為惡性腫瘤的不良預后因素之一。

腫瘤的發生發展有賴于新生血管生成。腫瘤新生血管生成由多種基因、細胞因子及信號通路協同調控，這些因素都有可能成為抑制腫瘤新生血管生成的作用靶點。APN參與腫瘤的血管生成。研究證明，APN是血管內皮生成中Ras信號通路的重要靶點，參與腫瘤新生血管的形成，受抑制后能夠阻止內皮細胞的遷徙及內皮形態的發生[8]。而針對腫瘤血管我們先前亦做了一些相關研究，如VEGF信號通路與DLL4-Notch信號通路，均是抗新生血管治療的靶目標。其中，VEGF是目前已知的作用最強的促血管生成因子之一。VEGF廣泛分布于人和動物的大腦、肝臟、胰腺、脾臟、腎臟及骨骼組織中，在正常生理狀態下呈低表達，但在病理環境下，尤其是腫瘤組織中可出現異常表達。VEGF能特異性作用于血管內皮，它通過與血管內皮細胞相應受體結合，刺激血管內皮細胞的有絲分裂和遷移以及血管的形成，并增強血管通透性，從而為腫瘤細胞提供充足的營養及侵襲轉移基質，是乳腺癌免疫組化常用指標之一。

APN可降解細胞外基質為新生血管生長提供空間，同時可將貯存在基質中與血管生成有關的因子如堿性成纖維生長因子釋放，使其發揮作用。有研究發現，APN唯獨表達于腫瘤新生血管的內皮細胞，而在正常組織血管內皮不表達[9]。本實驗研究亦發現，APN選擇性地表達于乳腺癌新生血管內皮，在癌旁正常乳腺組織血管內皮無表達。Bhagwat等[3]研究發現，在腫瘤微環境中，缺氧、VEGF等血管生成因子可誘導內皮細胞APNmRNA的表達。于是，本實驗比較了乳腺癌組織上VEGF與APN的表達的相關性，來進一步研究VEGF與APN在腫瘤血管發生過程的相互關系。結果顯示，乳腺癌組織上VEGF與APN的表達無直線相關關系，但VEGF陽性組APN陽性率高于VEGF陰性組。提示，APN可能是VEGF信號通路的下游靶點之一。另有證據顯示，APN的功能性抑制劑可以干擾血管形成，卻不影響原始血管內皮細胞的增生，提示，APN的功能是影響血管內皮形態發生，是在血管形態發生上起調節作用[15]。VEGF促進血管內皮的增殖，而APN影響血管內皮形態的發生，二者在新生血管生成上可能存在一定的協同作用。

有研究發現抗APNmAb和APN抑制劑均可破壞毛細血管網的形成。在胰腺腫瘤和非小細胞肺癌上，APN的表達與腫瘤新生血管形成呈正相關[6-7]。APN選擇性地表達于腫瘤新生血管的內皮細胞，并且，APN是天門冬氨酸-甘氨酸-精氨酸（A sn-Gly-Arg，NG R）多肽的特異性受體。基于這幾項發現，APN已經被提議為抗癌治療策略上的一個很有吸引力的靶點。將NGR連接到抗癌藥物上，就可以不管是什么類型和起源的腫瘤，高選擇性地作用于腫瘤血管[10-11]。另外，應用APN抑制劑Ubenimex可以明顯增強宮頸癌對放療的敏感度[12]。Christ等[13]聯合應用APN抑制劑可以增強5-FU對肝癌的化療效果。對手術切除的Ⅰ期肺鱗癌，APN抑制劑輔助治療可延長患者生存期[14]。因此，明確患者腫瘤是否表達APN，是應用這些新的抗癌藥物的先決條件。

綜上所述,APN在乳腺癌組織上表達，參與腫瘤的血管生成和侵襲轉移，結合國內外的研究報道，認為可將APN作為乳腺癌的一個重要標志物，并有可能成為未來乳腺腫瘤靶向治療的方向之一。而APN的表達激活以及其功能的有效發揮受體內外環境等多種因素的影響，這一領域尚有很多未知的東西有待探討。因此，對APN進一步的深入研究及研發靶向性強的APN抑制劑，將對以后惡性腫瘤的臨床輔助治療提供重要幫助。

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（2014-06-09收稿）

Functionsofam inopeptidase N in breast cancer angiogenesisand its correlation w ith VEGF

CAOWen-qing,NINGDian-bin,FENG Li,ZHAOYu-zhe,ZHANG Jing
（Departmentof The FirstGeneralSurgery,HebeiGeneralHospital,Shijiazhuang050051，China）

Objective:To investigate theexpression and significanceofaminopeptidase N (APN)in breastcancer,meanwhile,toexplore the relationship between APNand vascularendothelialgrowth factor(VEGF),and todiscuss the functionsofAPN inangiogenesisofbreast cancer.Methods:Immunohistochemistry(SPmeans)wasperformed tomeasure theexpression ofAPN in 60 casesofbreastcancer tissues and 20 casesofadjacentnormalbreasttissues.Results:APNmainlywasexpressed in themembraneofmalignantcells,and thepositive rate ofAPN expression in breastcancer tissueswashigher than thatin adjacentnormalbreast tissues,36.7%(22 outof60)and 0%(0 outof20) respectively(χ2=10.115,P=0.001).APNexpressionwasassociatedwith tumorpathological type(P=0.035).Furthermore,APN expression in neovascular endothelium was also observed in breast cancer tissues while no expression was found in normal endothelium.Under the correlation analysis,no linear correlationwas found between the APN expression and VEGFexpression (rs=0.078,P=0.553).However,the APN positive rates in VEGFpositivegroup and in VEGFnegativegroupwere44.7%（21 outof47），7.7%(1 outof13)respectively,showing the APN expressionwasmore often observed in VEGFpositive group than in VEGFnegative group(χ2=4.512,P=0.034).Conclusion:A synergistic effectmay existbetween APN and VEGF in the function of tumor angiogenesis in breast cancer,and the expression of APN in breastcancermay indicatesa poorprognosis.APN could function asan effective targetin anti-cancer therapy.

aminopeptidase N/CD13;immunohistochemistry;breastcancer;vascularendothelialgrowth factor

R737.9

A

1006-8147（2015）01-0039-04

曹文慶（1968-），男，主治醫師，學士，研究方向：乳腺及甲狀腺外科診治及基礎研究；通信作者：張靜，E-mail:zhangjing166@ 126.com。