氯化鋰調控人肺腺癌A549細胞增殖及侵襲轉移的體外研究

林高陽，徐克

（天津醫科大學總醫院肺部腫瘤外科，天津市肺癌研究所，天津市肺癌轉移與腫瘤微環境重點實驗室，天津300052）

論著

氯化鋰調控人肺腺癌A549細胞增殖及侵襲轉移的體外研究

林高陽，徐克

（天津醫科大學總醫院肺部腫瘤外科，天津市肺癌研究所，天津市肺癌轉移與腫瘤微環境重點實驗室，天津300052）

目的：探討氯化鋰對人肺腺癌A549細胞增殖和侵襲轉移能力的影響及其調控機制。方法：應用MTT法、平板克隆形成實驗評價細胞生長活力和增殖的生物學特征變化；劃痕實驗、Transwell小室細胞體外侵襲實驗檢測腫瘤細胞遷移、侵襲能力；Western-blotting法檢測腫瘤細胞GSK-3β、P-GSK-3β和β-catenin的表達水平變化。結果：MTT法顯示細胞分化增殖能力隨氯化鋰濃度的增加受到明顯抑制，具有濃度依賴性變化。同時，隨著檢測時間的延長，在低濃度藥物作用下（<10mmol/L）細胞出現增殖增強現象，可能存在藥物時間耐受；平板克隆形成實驗顯示細胞增殖受到不同濃度氯化鋰的抑制，增殖能力的變化亦具有氯化鋰濃度依賴性；劃痕實驗、Transwell實驗證實：氯化鋰處理細胞后，細胞遷移、侵襲能力下降；Western-blotting法顯示：氯化鋰處理肺腺癌A549細胞后，GSK-3β總蛋白表達下降、P-GSK-3β表達增加，β-catenin總蛋白表達增多。結論：高濃度的氯化鋰能夠抑制肺腺癌A549細胞的增殖和侵襲遷移，氯化鋰抑制肺腺癌A549細胞增殖和侵襲遷移可能是通過GSK-3β/β-catenin信號通路實現的。

肺腺癌；氯化鋰；遷移侵襲；GSK-3β/β-catenin通路

肺癌占全球惡性腫瘤發病率的12.7%，死亡率的18.2%，均高居首位[1]。肺癌分為非小細胞肺癌和小細胞肺癌，非小細胞肺癌是最常見類型，目前約占全部肺癌患者的80%，其中肺腺癌占50%，5年生存率約為15%。肺癌轉移是肺癌的惡性標志和特征，也是肺癌病人治療失敗和死亡的主要原因，約80%～90%的肺癌病人死于轉移[2]。目前尚無有效抑制肺癌轉移的藥物。鋰是一種經美國FDA（Food and Drug Administration）批準首選用于治療雙相情感障礙性疾病的藥物，并已被安全用于臨床數十年[3]。研究顯示，精神障礙性病人中接受鋰治療的患者比未接受鋰治療者患癌風險明顯降低，患癌風險和鋰劑量間表現出一個顯著的反比關系[4]，鋰可抑制多種腫瘤細胞的增殖分化[5]，被認為是一種有效的抗癌劑，亦可作為放化療的輔助[6-7]。鋰（Li+）對人體具有廣泛的生物學活性，涉及胚胎發育、免疫調節、細胞增殖和分化等。近來，其抗癌作用日益受到研究者的關注。GSK-3β（Glycogen synthase kinase-3β）是鋰作用的最常見的細胞內靶點之一[8]，如通過鋰抑制GSK-3β使前列腺癌和肝癌對TRAIL誘導的細胞凋亡更加敏感[9-10]。最近研究發現Wnt/βcatenin信號通路的異常激活與多種人類惡性腫瘤的發生、發展密切相關，然而氯化鋰靶向抑制GSK-3β，調控肺腺癌A549細胞增殖及侵襲遷移能力的研究尚罕見報道。本文就氯化鋰作用肺腺癌A549細胞進行初步的功能研究，以期發現調控肺癌增殖及侵襲遷移的信號通路，為氯化鋰治療肺癌增殖及侵襲遷移奠定初步的研究基礎及探究方向。

1 材料和方法

1.1 細胞系和細胞培養 人肺腺癌細胞系A549購自美國模式培養物保藏所（American Type Culture Collection.ATCC，Manassas,VA,USA），A549細胞從液氮中取出復蘇后用含有10%胎牛血清（Gibco公司），1%丙酮酸鈉，1%谷氨酰胺，1%非必需氨基酸的RPMI-1640（Gibco公司）培養基在37℃、5%CO2濕度的孵箱中孵育培養。

1.2 細胞分化增殖能力測定 取對數生長期的人肺腺癌A549細胞株，按1×104個/孔細胞，培養液補足至200μL/孔，將細胞懸液接種至96孔培養板孵育培養，細胞貼壁后用含有不同濃度的氯化鋰培養液置換96孔板中的培養液每孔200μL，并保證實驗組終濃度分別達到0、5、10、25、50、80mmol/L，每個濃度分別設空白對照，每實驗組均設4個復孔。繼續37℃、5%CO2濕度下孵育培養24、48、72、96 h后加入MTT（噻唑藍）溶液（5mg/mL用PBS配制，PH=7.4）20μL/孔繼續孵箱內孵育培養4 h，吸棄板孔內細胞培養液，每孔加入150μLDMSO終止培養，避光平搖震蕩10～15min，使甲瓚結晶物充分溶解。用酶聯免疫監測儀測定490 nm波長處吸光度(A)值，按下列公式計算細胞分化增殖活性：細胞分化增殖抑制率=（1-A490值/對照組A490值）×100%，以氯化鋰設置濃度為橫坐標，細胞分化增殖抑制率為縱坐標做折線圖，實驗重復3次。

1.3 平板克隆形成實驗 肺腺癌A549細胞2 000個/孔接種于6孔板中，用含有10%胎牛血清、1%丙酮酸鈉、1%谷氨酰胺、1%非必需氨基酸的RPMI-1640培養基配制不同終濃度（0、5、10、25、50、80 mmol/L）的含氯化鋰培養液在37℃、5%CO2濕度的孵箱中孵育培養120 h，棄去培養液，PBS洗滌2遍，500μL/孔甲醇固定15min，棄固定液加入500μL結晶紫染色液室溫染色30min，吸棄染色液PBS沖洗3遍室溫干燥，倒置熒光顯微鏡下拍照計數細胞數，計算克隆形成率=（克隆數/接種細胞數）×100%，以氯化鋰處理濃度為橫坐標、克隆形成率為縱坐標作柱狀圖。

1.4 劃痕實驗檢測細胞遷移能力 對數生長期肺腺癌A549接種于6孔板中，使次日細胞貼壁后融合密度達60%左右，用含有10%胎牛血清、1%丙酮酸鈉、1%谷氨酰胺、1%非必需氨基酸的RPMI-1640培養基配制不同終濃度（0、5、10、25、50、80mmol/L）的含氯化鋰培養液在37℃、5%CO2濕度的孵箱中孵育培養24 h，細胞貼壁后，用1mL無菌Tip槍頭在6孔板中劃出一道清晰創痕，棄去培養液PBS輕輕沖洗，換入新培養液于倒置熒光顯微鏡（Nikon, Tokyo,Japan）4倍下選取同一位置分別于劃痕后0、24、48、72、96、120 h拍照，比較創痕變化檢測細胞遷移能力。

1.5 Transwell小室實驗檢測細胞侵襲能力 對數生長期肺腺癌A549接種于6孔板中，細胞貼壁后配制含有不同濃度的氯化鋰培養液處理細胞，繼續培養24 h，無血清RPMI-1640以5∶1比例稀釋Matrigel基質膠，100μL/孔鋪入小室內室底部，37℃孵箱內放置30min～2 h，50μL無血清RPMI-1640培養液水化基質膠，吸棄用氯化鋰處理后6孔板中培養液，PBS清洗胰酶消化收集細胞沉淀,用無血清RPMI-1640培養液重懸使其成單細胞懸液，細胞計數以2×104個/孔，200μL加入小室內室，外室內加入700μL含10%胎牛血清、1%丙酮酸鈉、1%谷氨酰胺、1%非必需氨基酸的RPMI-1640培養液，繼續培養48 h吸棄培養液，PBS清洗外室，無菌棉簽擦拭內室基質膠和細胞，甲醇固定小室基底膜15 min，結晶紫染色30min，PBS清洗室溫干燥，倒置熒光顯微鏡下照相，選取5個視野計數計算不同濃度氯化鋰處理后細胞侵襲的平均數，以氯化鋰處理濃度為橫坐標、細胞數為縱坐標作柱狀圖。

1.6 Western-blotting免疫印跡技術檢測蛋白表達變化 不同濃度氯化鋰處理后的肺腺癌A549細胞于48 h收集細胞總蛋白，蛋白樣品與5×SDS-PAGE上樣緩沖液按4∶1比例混合，煮沸變性5～10min。電泳時樣品的加樣量為每孔20μL，彩虹預染Marker加樣量各為5μL，濃縮膠濃度5%，分離膠濃度10%，在Tris-glycine-SDS電泳緩沖液中以120 V電泳1 h；電泳完畢后用濕轉方法將分離的蛋白條帶轉移到NC膜；載有蛋白質條帶的膜在含有5%脫脂奶粉的TBST-buffer中室溫封閉1 h，然后加入含有5%BSA-buffer稀釋一抗[抗GSK-3β1∶5 000、抗PGSK-3β（phosphorylation-GSK-3β）1∶1 500、抗βcatenin 1∶400，β-actin作為對照1∶5 000]，4℃下振蕩孵育過夜，TBST-buffer洗滌后（15min/次共3次），加入含1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶（HRP）偶聯抗體反應液（相應蛋白的Ⅱ抗、5%脫脂奶粉稀釋），室溫中振蕩孵育1 h。洗滌后在膜上加ECL化學發光顯示液，室溫作用1min后于暗盒中曝光柯達膠片。圖片掃描結果應用Photoshop作圖軟件處理。

2 結果

2.1 MTT檢測氯化鋰處理A549細胞后細胞活力的變化 氯化鋰處理A549細胞24、48、72、96 h后，MTT檢測細胞活力顯示，A549細胞活力受到顯著抑制，且具有氯化鋰濃度依賴性變化和時間依賴性變化（圖1，表1）。隨著氯化鋰濃度增高，細胞成活率下降，對細胞抑制程度加強，但是在72 h低濃度氯化鋰（<10mmol/L）出現了促進增殖的變化。

圖1 MTT檢測氯化鋰處理A549后不同時間細胞增殖能力變化Fig 1 The cell proliferation ability of A549 determ ined by M TT assay after 24,48,72,96 h lithium chloride treatment

表1 時間和濃度變量條件下，氯化鋰處理A549細胞后吸光度值的變化（±s）Tab 1 Theabsorbance valueof A549 cellsafter variab le conditions (tim eand concentration)of lithium chloride treatm ent(±s)

表1 時間和濃度變量條件下，氯化鋰處理A549細胞后吸光度值的變化（±s）Tab 1 Theabsorbance valueof A549 cellsafter variab le conditions (tim eand concentration)of lithium chloride treatm ent(±s)

*同一時間點下與0mmol/L組比較，P<0.05

氯化鋰濃度0mmol/L 5mmol/L 10mmol/L 25mmol/L 50mmol/L 80mmol/L 24 h 1.382±0.222 1.316±0.316* 1.156±0.071* 1.186±0.059* 1.167±0.113* 0.979±0.104* 48 h 1.222±0.059 1.134±0.053* 1.113±0.019* 1.021±0.029* 0.956±0.091* 0.740±0.049* 72 h 1.187±0.130 1.245±0.091 1.228±0.121 0.545±0.434* 0.667±0.234* 0.784±0.139* 96 h 1.296±0.110 1.203±0.127* 1.106±0.089* 1.162±0.469* 0.737±0.208* 0.829±0.058*

2.2 平板克隆形成實驗分析氯化鋰處理A549細胞后增殖能力的變化 氯化鋰處理A549細胞120 h后，集落形成實驗檢測細胞增殖能力顯示，隨著氯化鋰濃度逐漸增加，肺腺癌A549細胞增殖形態學和數量受到顯著抑制（圖2、3）。

圖2 平板克隆形成實驗檢測氯化鋰處理A549細胞后120 h克隆形成率的變化Fig 2 Cloning efficiency of A549 determ ined by colony proliferation assay after 120 h lithium chloride treatment

2.3 劃痕實驗檢測氯化鋰處理肺腺癌A549后細胞遷移能力的變化 氯化鋰處理A549細胞后，劃痕實驗檢測細胞遷移能力顯示，隨著氯化鋰濃度增加，處理時間延長，肺腺癌A549細胞遷移能力減弱，創痕寬度與氯化鋰濃度之間存在正相關性，創痕寬度與氯化鋰處理時間之間存在負相關性（圖4）。

2.4 Transwell小室實驗檢測氯化鋰處理A549細胞后侵襲能力的變化 運用Transwell小室實驗檢測氯化鋰處理肺腺癌A549細胞后48 h，腫瘤細胞的侵襲轉移能力，結果見圖5、6，氯化鋰處理肺腺癌A549細胞后，腫瘤細胞的侵襲和遷移狀態受到明顯抑制，顯微鏡下細胞計數穿過Transwell小室的細胞數明顯降低，侵襲能力受到明顯抑制。

2.5 Western-blotting免疫印跡技術檢測氯化鋰處理細胞后蛋白水平變化 Western-blotting免疫印跡技術檢測顯示：氯化鋰處理肺腺癌A549細胞后，GSK-3β總蛋白表達下降、P-GSK-3β表達增加，βcatenin總蛋白表達增多（圖7）。

圖3 平板克隆形成實驗檢測氯化鋰處理A549后120 h細胞形態學的變化Fig 3 M orphology of A549 determ ined by colony proliferation assay after 120 h lithium chloride treatment

圖4 劃痕實驗檢測氯化鋰處理A549后細胞遷移能力的變化Fig 4 M igration capability of A549 dem onstrated by wound scratch assay after lithium chloride treatm ent

圖5 Transwell小室實驗檢測氯化鋰處理A549后48 h細胞侵襲和遷移狀態的變化（×100）Fig 5 Invasion and m igration status of A549 demonstrated by Transwellassay after 48 h lithium chloride treatment（×100）

細胞數：在圖5中，相同時間點不同濃度氯化鋰處理下，100X視野下選取5個視野計數A549細胞穿過Matrigel基質膠的平均數；*同一時間點下與0mmol/L組比，P<0.05

圖7 蛋白免疫印跡技術檢測氯化鋰處理細胞后48 h蛋白水平的變化Fig 7 The expression of GSK-3β/β-catenin pathway relative proteins detected by wastern blotting after 48 h lithium ch loride treatm ent

3 討論

目前肺癌的主要治療方法是外科手術治療、放療、化療和生物治療等。肺癌的治愈率僅為15%～17%左右。外科手術治療非小細胞肺癌的5年生存率為30%～40%，然而絕大多數患者就診時都已處于中晚期，錯過了手術治療的機會。放療為一種局部治療，其療效是有限的，治療肺癌的5年生存率低于5%，同時亦有劑量限制性、毒性問題。化療可用于幾乎全部肺癌患者，因此抗腫瘤藥物治療成為中晚期肺癌患者的主要治療手段。肺癌的侵襲轉移是導致患者臨床治療失敗的重要原因。轉移傾向是一系列的生物學過程，是指能使腫瘤細胞從起源部位到達遠處局部并形成新的轉移灶生長的運動。它包括以下幾個步驟：侵襲周圍組織，侵入淋巴微脈管系統和血液系統，進而轉移至遠處組織的微管系統繼續生長，溢出血管到達遠處組織的微環境內生長，最終適應這些組織的促進細胞增殖的異質微環境，進而最終形成繼發腫瘤[11]。然而，目前肺癌細胞轉移的機制仍然知之甚少，肺癌的轉移是一個多步驟、多階段、多因素和多基因調控的復雜過程，因此控制肺癌的侵襲和轉移是改善肺癌患者預后，提高患者生存率和生活質量的最重要的措施。

WNT信號通路是胚胎形成和發育過程中的關鍵因子，與多種腫瘤的發生有著密切的關系，是腫瘤學和再生醫學中藥物基因組學研究的熱點。近年來，WNT信號通路與腫瘤的關系已引起人們的關注，針對WNT信號通路不同基因靶點的高特異性基因藥物已被研發，腫瘤的分子診斷也相繼出現。目前，以WNT信號通路為靶點的腫瘤基因治療主要包括細胞膜水平、胞內通路成員蛋白水平、βcatenin水平和核內TCF/LEF-β-catenin復合體水平。糖原合成酶激酶-3（GSK-3）是普遍存在于真核生物的一種多功能絲氨酸/蘇氨酸激酶，包括GSK-3α和GSK-3β，但目前對兩個亞型之間是否有不同作用研究較少。目前認為GSK-3β參與并調控WNT/β-catenin信號傳導通路，是WNT/β-catenin信號通路的關鍵酶，它能夠有效的促進APC蛋白、軸蛋白和β-catenin的磷酸化，最終使β-catenin泛素化而降解。Hiroyuki等[12]研究發現：GSK-3β參與非經典的WNT5a信號通路，WNT5a可以引起多種腫瘤細胞的遷移，GSK-3β可以通過調節ROR2受體的水平影響WNT5a誘導的細胞遷移。Zhan等[13]研究表明氯化鋰是GSK-3β的高度選擇性抑制劑。Gould等[14]研究發現，氯化鋰可以通過抑制GSK-3β從而緩解腫瘤化療所引起的白細胞缺乏，同時又通過臨床試驗證實氯化鋰不會促進或影響腫瘤發生發展，但未對氯化鋰對腫瘤的治療作用做進一步闡釋。Beurel等[15]研究發現，在肝癌細胞中，氯化鋰可以引起GSK-3β的磷酸化失活，進而影響細胞膜上CD95的表達，并抑制依托泊苷、喜樹堿等化療藥物所引起的細胞凋亡。但氯化鋰對未經化療腫瘤細胞的作用未見研究報道，尤其是對肺癌尚未見報道。在本實驗研究中我們進一步驗證氯化鋰靶向抑制GSK-3β的表達，使P-GSK-3β水平增加功能降低，可能通過激活Wnt/β-catenin信號通路，抑制肺癌細胞的增殖和侵襲轉移。

本研究初步探究了氯化鋰在不同濃度下對肺腺癌A549細胞增殖作用的影響，初步得出氯化鋰對肺癌細胞增殖有一定的濃度依賴相關性，在低濃度（＜10mmol/L）時可見氯化鋰對肺癌A549細胞增殖作用的強化，可能是由于低劑量下隨時間的延長藥物毒性作用弱化，細胞出現低劑量藥物耐受所致；較高濃度時不僅表現出了對肺癌細胞的增殖抑制同時也表現出了對肺癌細胞的凋亡誘導。通過劃痕和小室實驗進一步研究了氯化鋰對肺癌A549細胞侵襲轉移的功能學表現，實驗研究證實氯化鋰在一定濃度劑量下促進增殖及抑制腫瘤細胞遷移侵襲的作用。依據文獻報道，氯化鋰作為高度特異的GSK-3β抑制劑及WNT/GSK-3β/β-catenin信號通路在腫瘤研究中作用功能，通過Western-blotting法檢測了氯化鋰處理肺癌細胞后相關蛋白的變化，進一步揭示了氯化鋰對肺腺癌A549細胞增殖和侵襲遷移的體外抑制作用的機制，初步探究了其在濃度依賴性條件變化下，不同時間點上發揮抑制增殖、侵襲轉移作用的分子生物學行為，為進一步研究氯化鋰究竟能否成為將來臨床用于治療肺癌的藥物使用奠定了強有力的理論基礎，也為進一步解答其在較高濃度時發揮抑制腫瘤增殖、侵襲遷移，促進腫瘤細胞凋亡以及對腫瘤細胞生長周期的影響指出了一個方向。肺癌侵襲轉移的分子機制究竟有多復雜？氯化鋰調控作用所經的信號通路究竟是什么？氯化鋰作用肺癌細胞后所表現出來的一系列生物學行為如何做出生物信息學解釋還有待更加深入地研究。

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（2014-08-28收稿）

Investigation of the effect of lithium chloride on proliferation and metastasis potential of hum an lung adenocarcinoma A549 cells in vitro

LINGao-yang，XUKe
（Department of Lung Cancer Surgery，General Hospital，Tianjin Medical University，Tianjin Lung Cancer Institute，Tianjin Key Laboratory of Lung CancerMetastasisand TumorMicroenvironment，Tianjin 300052，China）

Objective:To investigate themechanism of lithium chloride impacton proliferation and invasion abilitiesofhuman lung cancer cell A549.Methods:Cellgrowth and proliferationwere determined by MTTmethod and colony proliferation assay.Migration and invasion abilitiesofhuman lung cancer cellA549were detected bywound scratch assay and Transwellassay.The expression ofGSK-3β(Glycogen synthase kinase-3β),P-GSK-3β (Phosphorylation-GSK-3β)andβ-catenin ofhuman lung cancer cellA549were detected bywesternblotting.Results:The proliferation of A549 was significantly decreased after treated with lithium chloride indicating a lithium chloride concentration-dependentmanner.Meanwhile,with the extension of the detection time,enhanced cell proliferation phenomenon was observed at low concentrations(<10mmol/L)，indicatinga time-toleranceof the drug.The proliferation ofA549 could alsobe inhibited by lithium chloride with a dose-dependentmanner.Themigration and invasion capabilities of A549 decreased after treated with lithium chloride.And Itwas also found that the expression of GSK-3βwas decreased while the expression of P-GSK-3βandβ-catenin were increased after lithium chloride treatment.Conclusion:High concentration of lithium chloride could inhibitthe proliferation and invasion of A549,and thismaybeacheived by GSK-3β/β-catenin signalingpathway.

lungadenocarcinoma;lithium chloride;metastasis/invasion;GSK-3β/β-catenin signaling pathway

R734.2

A

1006-8147（2015）01-0009-05

國家自然科學基金資助項目（81372519，30873035）；教育部留學回國人員科研啟動基金，教育部博士點基金（20131202110 005）；天津市應用基礎及前沿技術研究計劃重點項目（14JCZDJC33800,10JCZDJC20800）；天津市高等學校科技發展基金計劃重點項目（ZD200714）

林高陽（1988-），男，碩士在讀，研究方向：肺癌的侵襲轉移；通信作者：徐克，E-mail:ke_xu@hotmail.com。