同型半胱氨酸對小鼠成神經瘤細胞毒性作用研究

茍 蕓，黃國偉，陳 爽，張緒梅

（天津醫科大學公共衛生學院營養與食品衛生學系，天津300070）

論著

同型半胱氨酸對小鼠成神經瘤細胞毒性作用研究

茍 蕓，黃國偉，陳 爽，張緒梅

（天津醫科大學公共衛生學院營養與食品衛生學系，天津300070）

目的：研究同型半胱氨酸（Hcy）對小鼠成神經瘤細胞（N2a）毒性作用并探討其對pERK1/2蛋白表達的影響。方法：培養的N2a細胞加入不同濃度Hcy，隨機分為4組：分別為正常對照組及Hcy低、Hcy中、Hcy高濃度組，根據預實驗結果確定以上4組Hcy干預濃度分別為0、30、300和1 000μmol/L。作用72 h后，用酶標儀測定細胞培養液中乳酸脫氫酶（LDH）活性，MTT法檢測細胞增殖情況，蛋白質免疫印跡法檢測N2a細胞pERK1/2蛋白表達水平。結果：與正常對照組相比，Hcy低、中、高濃度組細胞培養液中LDH活性均顯著升高，差異具有統計學意義（P值分別為0.013、0.008和0.011，P<0.05）。低、中、高濃度Hcy作用后，MTT檢測細胞增殖活力下降，OD值降低，與對照組比較，差異具有統計學意義（P值分別為0.01、0.006和0.009，P<0.05）。各Hcy干預組pERK1/2蛋白表達量降低，且中、高濃度Hcy組pERK1/2蛋白表達量與對照組相比差異具有統計學意義（P值分別為0.038、0.007，P<0.05）。結論：Hcy能抑制磷酸化的ERK1/2蛋白表達，從而對N2a產生毒性作用，進而抑制N2a增殖，提示降低血清中Hcy水平可以對神經細胞產生保護作用。

同型半胱氨酸；小鼠；成神經瘤細胞N2a；細胞凋亡；pERK1/2

同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是一種體內不能自行合成的含硫四碳氨基酸，也是蛋氨酸和半胱氨酸重要的中間代謝產物。流行病學研究顯示，血漿中Hcy水平升高是阿爾茲海默癥、血管性癡呆、帕金森病和中風等神經退行性疾病的危險因素之一[1-2]。此外，有研究報道，母體內Hcy濃度升高可以導致胎兒神經管畸形[3]。Hcy可增加血腦屏障的通透性導致大腦對Hcy的暴露，發揮其神經毒性作用[4]。有關Hcy如何損傷神經系統，以及引發神經退行性病變的具體機制尚不清楚。目前研究認為，Hcy發揮神經毒性作用的機制較為復雜，可能與N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受體過度激活、氧化應激損傷及低甲基化等有關[5-7]。細胞外信號調節激酶（external-signal regulated kinase, ERK）1/2是介導神經細胞損傷的一種重要信號蛋白分子，但目前有關ERK1/2如何介導神經細胞的損傷少有報道。小鼠N2a成神經瘤細胞系是一種來源于腦組織的細胞系，是進行神經系統研究的重要細胞模型。本實驗以N2a細胞為受體細胞，研究Hcy是否通過調控pERK蛋白表達發揮其毒性作用。

1 材料與方法

1.1 材料 同型半胱氨酸（H4628）購于Sigma公司；DMEM（#10569）購于Gibco公司；兔抗大鼠多克隆一抗ERK1/2（#4695）、pERK1/2（#4370）購自Cell Signaling公司；BCA蛋白試劑盒（AR1046）購于博士德公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗（IH-0011）購于北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；ECL化學發光底物試劑盒（WBKIS0100）購于Merck Millipore公司；乳酸脫氫酶（LDH）測試盒（A020-2）購自南京建成生物工程研究所；小鼠成神經瘤細胞N2a（目錄號：TCM29）購自中國科學院細胞庫。

1.2 方法

1.2.1 N2a細胞培養 N2a細胞在含有10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養液中貼壁生長。將細胞接種于直徑60mm培養皿置于37℃，5%CO2培養箱中培養。待細胞完全貼壁，濃度約為5×106，將其分為4組：正常對照組、Hcy低、Hcy中、Hcy高濃度組，以上4組Hcy干預濃度分別為0、30、300、1 000 μmol/L。作用72 h后收集細胞和培養液進行相關指標的檢測。

1.2.2 以LDH試劑盒檢測LDH活性 收集72 h各組細胞培養液，按試劑盒說明書操作。于96孔板中分別加入相應的試劑，混勻，室溫放置5min，于波長450 nm處用酶標儀測吸光度值。LDH活性（U/L）×標準品濃度×1 000，計算LDH活性。

1.2.3 MTT法檢測細胞增殖活力 將細胞制成懸液，調整細胞密度為1×104/mL，接種于96孔板，每組8個復孔，每孔200μL，同時做空白對照。分別于24、48、72、96 h后每孔加MTT 20μL，繼續培養4 h，離心后棄孔內培養上清液，加入150μLDMSO，振蕩10min，使結晶物充分溶解后，用酶標儀于490 nm波長下測光密度（OD）值。

1.2.4 Western blot檢測細胞中pERK和ERK蛋白表達 收集細胞后用PBS洗兩次，800 r/min離心3 min，棄上清。加150μL裂解液后超聲3次（20Hz，每次10 s，間隔10 s）。16 000×g，4℃離心15min，取上清液。細胞中蛋白濃度用BCA蛋白試劑盒檢測。將等量蛋白（約30μg）在10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳，轉NC膜。將膜分別放在含p-ER K（1∶2 000）和ER K（1∶2 000）的抗體中4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加山羊抗兔二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，用化學發光底物試劑顯色。蛋白條帶用ImageJ2.0軟件進行定量分析。

1.3 統計分析 計數資料結果采用SPSS 13.0統計軟件處理數據，多組間比較采用單因素方差分析，若組間差異有統計學意義，各組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。數據以±s表示，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞形態觀察 光鏡下可見，正常N2a細胞貼壁生長，呈圓形或豆狀，簇擁成團，邊緣光滑，折光性較強，個別細胞有軸突。與對照組相比，各Hcy干預組細胞量減少，單個散在細胞增多；細胞不易“抱團”且出現細胞碎片，Hcy高濃度組尤其明顯（圖1），提示Hcy可導致N2a細胞明顯損傷。

圖1 N2a細胞形態學觀察（×100）Fig 1 M orphologic observation of N2a cells(×100)

2.2 Hcy對N2a細胞的毒性作用 細胞培養液LDH活性檢測發現，低、中、高濃度Hcy干預組的LDH活性均高于正常對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。表明Hcy造成細胞損傷，膜通透性增高，且在一定濃度范圍內，Hcy的毒性作用呈濃度依賴性。見表1。

表1 不同濃度Hcy對N2a細胞LDH活性的影響（n=3，±s）Tab 1 Theneurotoxicity of Hcy on N2a cells（n=3，±s）

表1 不同濃度Hcy對N2a細胞LDH活性的影響（n=3，±s）Tab 1 Theneurotoxicity of Hcy on N2a cells（n=3，±s）

與正常對照組比較aP<0.05；與Hcy低濃度組比較bP<0.05；與Hcy中濃度組比較cP<0.05

組別 LDH活性/（U／L）正常對照組 23.15±3.18 Hcy低濃度組 29.52±1.82aHcy中濃度組 33.66±3.76abHcy高濃度組 40.50±1.91abc

2.3 Hcy對各組N2a細胞增殖的影響 在干預48、72和96 h后各個時間點，Hcy低、中、高各濃度組的OD值均低于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。且Hcy濃度越高，OD值越低，說明其抑制N2a增殖的效果越明顯，見圖2。

與正常對照組比較aP<0.05

2.4 pERK1/2蛋白的表達 Western blot分析各組pERK1/2蛋白的表達發現，中、高濃度Hcy作用組pERK蛋白表達量低于正常對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。另外，與Hcy低濃度組比較，Hcy高濃度組pERK蛋白表達量亦顯著降低，差異均有統計學意義（P＜0.05），見圖3。

圖3 Hcy對pERK 1/2蛋白表達的影響Fig 3 TheHcy effectson thep rotein expression of pERK 1/2

3 討論

正常人體內血漿中Hcy濃度為5～15μmol/L[8]，遺傳因素引起Hcy代謝相關的亞甲基四氫葉酸還原酶、胱硫醚-β-合成酶缺乏或活性降低，或某些營養素缺乏（如葉酸、維生素B6、B12缺乏）均可導致高同型半胱氨酸血癥（hyperhomocysteinaemia,HHcy）[9]。研究表明高同型半胱氨酸能顯著提高在體和離體培養細胞中神經元的興奮性和氧化損傷[9]。本實驗MTT檢測結果Hcy干預組OD值小于對照組（P值分別為0.010、0.006和0.009，P＜0.05），說明Hcy可抑制N2a細胞的增殖活力。LDH是一種穩定的蛋白質，存在于正常細胞的胞質中，一旦細胞膜受損，LDH即被釋放到細胞外。本實驗通過檢測細胞培養液中LDH活性，發現Hcy干預組培養液LDH活性高于對照組（P值分別為0.013、0.008和0.011，P＜0.05），說明Hcy可對N2a細胞膜造成損傷。故光鏡下發現Hcy干預組細胞數量少于對照組的原因可能為Hcy抑制N2a增殖使產生子代細胞的數目減少或者是對細胞膜產生損傷進而引起細胞死亡數目增多造成。

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-actived protein kinase,MAPK）是真核生物信號傳遞網絡中的重要途徑之一，在基因表達調控和細胞質功能活動中發揮關鍵作用，其家族成員之一ERK1/2在中樞神經系統高度表達，調控神經細胞的生長、增殖與分化，并在神經細胞損傷機制中扮演著重要的角色[10-12]。有研究表明，葉酸缺乏可提高培養神經細胞內Hcy的濃度，且葉酸可通過激活ERK1/2磷酸化促進神經干細胞增殖[13-15]。本研究結果表明，Hcy干預可減少ERK1/2磷酸化水平抑制神經細胞增殖。鑒于機體內葉酸可作為Hcy代謝的輔助因子，促進Hcy合成甲硫氨酸，進而降低Hcy水平[17]，同時，流行病學研究和臨床調查發現，腦梗死等中樞神經系統疾病患者血清中的葉酸值明顯低于其他病人，而長期補充葉酸、維生素B6、B12等B族維生素可有效降低Hcy水平，促進腦損傷患者神經系統的生長、修復和恢復，并認為這種作用可能與葉酸影響神經細胞的增殖、分化與凋亡有關[18]。故我們推測Hcy濃度的改變可能介導葉酸對神經細胞增殖作用，葉酸可能通過降低Hcy濃度在神經系統發育及維持中起保護作用。本實驗將為葉酸及Hcy在神經系統疾病發生發展過程中作用機制的研究奠定基礎。

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（2014-07-30收稿）

Neurotoxicity ofhomocysteineonmouse N2a neuroblastoma cells

GOUYun，HUANGGuo－wei，CHENShuang，ZHANGXu－mei
（DepartmentofNutrition and Food Hygiene，SchoolofPublic Health，Tianjin MedicalUniversity，Tianjin 300070，China）

Objective：Toexplore theneurotoxicityofhomocysteine（Hcy）onmouseneuroblastoma cells（N2a）and itseffecton pERK1/2 protein level．Methods：Cultured N2a cellswere divided into fourgroups according to the concentrations ofhomocysteine：controlgroup（Hcy 0μmol/L），low－Hcy（30μmol/L），moderate－Hcy（300μmol/L），high－Hcy（1 000μmol/L）groups．After72 h Hcy treatment，the toxicity ofN2a cellswasdetected by LDH（lacate dehydrogenase）assay kit，cellproliferation abilitywas detected by MTTmethods，and the protein expression of pERK1/2 was detected by western blot．Results：The LDH activity in Hcy－treated groupswas increased compared with control group（P＜0．05）．The cells proliferation ability was decreased after Hcy treatment，and OD valueswere reduced comparedwith controlgroup（P＜0．05）．Theprotein expression ofpERK1/2 decreased afterHcy treatment，and significantdifferencesamong themoderate，high Hcydosegroupsand controlgroupwere found（P＜0．05）．Conclusion：The toxiceffectofHcyon N2a cellsmaybe caused by reduced ERK1/2 protein phosphorylation expression．Itsuggests thata low serum Hcy levelmay havea protectiveeffecton neuralcells．

homocysteine；mouse；neuroblastoma cell；cellapoptosis；pERK1/2

R15

A

1006－8147（2015）01-0006-03

國家自然科學基金資助項目（81373003）；中國博士后科學基金資助項目（2014M550148)

茍蕓（1990-），女，碩士在讀，研究方向：營養與神經退行性疾病；通信作者：張緒梅，E-m ail:zhangxumei@tijm u.edu.cn。