人巨細胞病毒感染DNA檢測和IgM檢測的比較及其聯合應用價值的探討

李玲霞，高　申，張　特，吳　苑

(1.中南大學湘雅三醫院 檢驗科，湖南 長沙410013；2.吉林大學中日聯誼醫院，吉林 長春130033)

人巨細胞病毒感染DNA檢測和IgM檢測的比較及其聯合應用價值的探討

李玲霞1,2，高申2，張特2，吳苑1*

(1.中南大學湘雅三醫院 檢驗科，湖南 長沙410013；2.吉林大學中日聯誼醫院，吉林 長春130033)

(ChinJLabDiagn,2015,19:0078)

人巨細胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)也稱人皰疹病毒5型，屬皰疹病毒β亞科，為線狀雙鏈DNA病毒[1]。HCMV在人群中感染率較高，常累及淋巴細胞、腎小管上皮細胞、肝膽上皮細胞等實質細胞，在產前診斷、新生兒體查、免疫力低下、常使用免疫抑制劑的患者和移植病人中動態監測HCMV-DNA有重要意義。本實驗以RT-PCR法檢測患者體液標本中HCMV載量，以ELISA法檢測血清HCMV-IgM，明確這兩種方法的陽性率，比較兩種方法單獨應用和聯合應用在對于診斷患者HCMV感染中價值[2-4]。此次實驗通過比較兩種不同的方法對HCMV感染檢測的陽性率，從而為臨床提供一種檢測HCMV的最佳方案。實驗的結論對基層醫院開展HCMV檢測項目的選擇也具有一定的指導意義。

1儀器與方法

1.1　標本來源

標本來自2011年-2013年中南大學湘雅三醫院各科室(n=441,男性=260，女性=181)，主要包括:新生兒病室、體檢中心、產科病室、移植科病室、兒科病室、急診科、血液內科病室、婦科病室等。

1.2　主要試劑

北京貝爾生物工程有限公司生產的HCMV-IgM抗體檢測試劑盒；中山大學安達基因股份有限公司生產的HCMV核酸定量檢測試劑盒(PCR-熒光法)，內含有DNA提取液、HCMV-PCR反應管(HCMV特異引物探針、酶系和Tris鹽酸緩沖液)、陽性定量參考品、弱陽性質控品、強陽性質控品、陰性質控品、稀釋液。

1.3　實驗方法

1.3.1HCMV-IgM抗體檢測加樣品于反應板中，同時預留陰性對照3孔、陽性及空白對照共5孔，然后經過搖勻、溫育、洗板、加辣根過氧化物酶標記物、溫育、洗板、顯色、終止步驟后，使用雙波長450/630 nm進行檢測，測定各孔A值，計算臨界值(Cut off=0.10+陰性對照平均A值，當陰性對照平均A值小于0.05時，按0.05計算；當陰性對照平均A值大于或等于0.05時按實際值計算)。A值大于等于臨界值的為陽性結果，小于臨界值的為陰性結果。

1.3.2DNA提取用煮沸裂解法按照HCMV核酸定量檢測試劑盒(PCR熒光法)的說明書操作處理陰性質控品、標本(尿、全血)、HCMV弱陽性質控品、HCMV強陽性質控品以及HCMV陽性定量參考品。

1.3.3PCR擴增取HCMV-PCR反應管若干，分別加入處理后上清液(含病毒DNA)以及陽性定量參考品各5 μl，離心后，放入儀器樣品槽。設置循環條件為93℃ 2 min預變性，93℃ 45 s→55℃ 60 s→先做10個循環，最后按93℃ 30 s→55℃ 45 s→做30個循環，于55℃45 s末收集熒光信號。根據陽性定量參考品的CT值作標準曲線，通過樣品的CT值計算DNA病毒載量，DNA拷貝數大于500 copies/ml結果為陽性，小于500 copies/ml為陰性。

2結果

2.1　HCMV-IgM檢測結果

采用ELISA定性檢測人血清或血漿樣品中HCMV-IgM，共檢測441例標本。其中陽性77例，占17.46%，陰性364例，占82.54%。

2.2　HCMV-DNA檢測結果

統計441例病人的HCMV-DNA檢測結果，陽性例數115例，占26.08%，陰性326例，占73.92%。

2.3　HCMV-IgM 和HCMV-DNA相關性分析

HCMV -IgM檢測結果和HCMV -DNA檢測結果比較，結果見表1，兩種方法均檢出陽性者69例；HCMV-IgM陰性而HCMV-DNA陽性的46例，HCMV-IgM陽性而HCMV-DNA陰性的8例；兩項檢測結果均為陰性的318例；χ2=26.74，P<0.005。按α=0.05水準，差別有統計學意義，故可以認為兩種方法的檢出率不同，檢測HCMV-DNA的RT-PCR方法檢出率較高。聯合檢測HCMV-IgM和 HCMV-DNA，可提高HCMV陽性檢出率，達27.89%(123/441)。

表1　HCMV-IgM和 HCMV-DNA相關性分析(n=441)

3討論

HCMV感染在免疫功能正常的人群多呈隱性感染或潛伏感染，但當機體免疫力降低時，潛伏狀態的HCMV可活化而引起發病，常見于器官移植后接受免疫抑制劑治療及惡性腫瘤患者接受化療導致免疫缺陷或免疫抑制狀態，如器官移植、腫瘤患者、艾滋病患者更容易遭受HCMV侵犯。另外，由于機體免疫力低下，HCMV感染可加重一些常見病患者原有疾病的癥狀甚至引起死亡。因此，對HCMV的檢測具有重要的價值，臨床上目前無檢測金標準，使用最多的是ELISA法以及RT-PCR法[5]。HCMV感染后可刺激人體產生特異性抗體，IgG抗體檢測不能提示急性感染，病毒包涵體雖提示病毒復制活躍，但檢測的陽性率太低[6-8]。通過檢測血清中HCMV-IgM可間接證實體內HCMV的存在。另外，HCMV-IgM在體內存留12～16周左右，因此在感染的早期或超過抗體存留時間采集的標本，HCMV-IgM抗體濃度均未達到可檢測的水平，并且HCMV感染的多為免疫功能低下患者以及新生兒，也影響到抗體生成的敏感性，導致假陰性的結果[9-11]。RT-PCR法檢測DNA屬于微量檢測，本試驗的檢測限為500 copies/ml。HCMV感染患者尿液標本HCMV-DNA結果陰性可能是由于腎小管上皮細胞雖已經受HCMV侵犯，但腎小管為間歇排出HCMV病毒顆粒[2,12]，檢測結果陰性并不能排除HCMV感染，此類患者需在不同的時間段取不同來源的樣本以確證是否有HCMV-DNA的存在。

RT-PCR在全國各級經過實驗室認證的實驗室都能普及，檢測基本自動化，降低了人為因素對檢測的干擾，具有特異性強、靈敏度高、定量準確、檢測重復性好、自動化程度高等諸多特點，因此對判斷病毒的活動性和評價抗病毒治療療效的動態監測有著重要的意義[13,14]，也彌補了病毒分離培養和抗原、抗體檢測的部分不足[4]。

HCMV-IgM檢測和HCMV-DNA的聯合應用價值:本次研究HCMV-IgM檢測陽性率為17.46%，HCMV-DNA檢測陽性率為26.08%，兩種檢測結合起來的陽性率為27.89%(123/441)高于兩者的單獨檢測。這提示兩種檢測方法對患者HCMV感染的聯合檢測提高了檢測的陽性率，降低了漏診率，從而減少了因漏診造成治療延誤帶來的不良后果，具有一定的臨床價值。本實驗仍然存在以下不足，樣本量不夠大，對陽性DNA結果沒有進行連續性檢測，進一步分析DNA載量與病程的關系。

RT-PCR檢測HCMV-DNA具有良好的應用前景，同時，對標本采集時間和采集類型的優化和規范化，將成為提高HCMV檢測的特異性和靈敏度、臨床醫生及時準確診斷HCMV感染的一個重要方面，也是今后研究HCMV感染檢測分析前質量控制的一個不可或缺的關鍵因素。

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摘要：目的通過實時熒光定量PCR(RT-PCR)法和ELISA法檢測患者體液中HCMV-DNA及HCMV-IgM，比較這兩種方法檢測的陽性率和推測其診斷人巨細胞病毒感染的價值。方法441名患者的標本用RT-PCR法檢測HCMV-DNA，用ELISA檢測HCMV-IgM，計算兩種方法的陽性率。結果兩種方法單獨檢測的陽性率分別為26.08%和17.46%，兩者比較，差異有統計學意義(χ2=26.74，P<0.005)，RT-PCR法的陽性率高于ELISA法。兩種方法聯合檢測的陽性率為27.89%(123/441)，高于兩方法單獨檢測陽性率。結論用RT-PCR法檢測尿液或血液標本HCMV-DNA與ELISA法檢測血清HCMV-IgM聯合應用提高了患者HCMV感染檢測的陽性率，減少了漏診率。

關鍵詞：人巨細胞病毒；實時熒光定量PCR法；ELISA法

Comparison of the detection of HCMV-DNA viral load and HCMV -IgM in serum with the human cytomegalovirus infection and its joint application valueLILing-xia,GAOShen,ZHANGTe,etal.(TheThirdXiangyaHospitalofCentralSouthUniversity,Changsha410013,China)

Abstract:ObjectiveTo detect HCMV viral load in body fluids and HCMV -IgM in the serum and to study the clinical value of the combined detection for the patients with human cytomegalovirus infection.MethodsIn 441 patients，HCMV-IgM in the serum was detected by ELISA and HCMV-DNA viral load in body fluids was detected by RT-PCR,compare with these two kinds of methods to detect the positive rate and the diagnostic value.ResultsThe positive rate of two methods were 26.08% and 17.46% respectively，the significance and the difference between two methods was obviously(χ2=26.74，P<0.005).The positive rate of combined detection by two methods was 27.89%(123/441)，which was higher than that of the single.ConclusionThe combined application of HCMV-IgM in the serum using ELISA and the copies of HCMV-DNA in urine using RT-PCR would raise the positive rate and reduce the missed diagnosis of detection for the patients with the human cytomegalovirus infection.

Key words:human cytomegalovirus;Serum;RT-PCR;ELISA

收稿日期：(2014-01-15)

文獻標識碼：A

中圖分類號：R446.5

文章編號：1007-4287(2015)01-0078-03

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