基于分子互作網絡的MMPs相關基因在胃癌組織中的表達研究

許建婷，金浩范，王冀邯，牛　超，高長曌，王國慶，李　凡*

(1.吉林大學基礎醫學院，吉林 長春130021；2.吉林大學第一醫院 腫瘤中心，吉林 長春130021)

基于分子互作網絡的MMPs相關基因在胃癌組織中的表達研究

許建婷1,2，金浩范2，王冀邯1，牛超2，高長曌1，王國慶1，李凡1*

(1.吉林大學基礎醫學院，吉林 長春130021；2.吉林大學第一醫院 腫瘤中心，吉林 長春130021)

(ChinJLabDiagn,2015,19:0056)

胃癌作為臨床常見的消化道惡性腫瘤，多年來困擾著我國的國民健康[1]。早期檢出率低是胃癌死亡率居高不下的關鍵原因，往往被診斷出中晚期的病例已伴隨著癌細胞的廣泛侵襲及遠處轉移，直接否決了手術根治的可能性[2]。基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)家族因其能夠降解細胞基底膜和基質、突破細胞外基質屏障，被認為與細胞的侵襲、擴散、轉移等過程直接相關[3]。已有研究顯示胃癌中部分MMPs家族成員表達異常，然而單個甚至數個分子并不能系統的詮釋胃癌的發展機制。作為酶類蛋白質，MMPs往往通過與其相關基因、蛋白相互作用，共同參與疾病的發生發展。因此全面的基因篩查及分子間相互作用網絡的探索對解釋疾病的發生發展至關重要。本研究以胃癌組織高通量芯片為信息基礎，整合BioGRID[4]數據庫信息，構建了胃癌組織中MMPs家族相關的分子互作網絡，旨在為胃癌的侵襲、轉移研究提供更多的分子學機制。

1材料與方法

1.1　標本采集

研究選取2012年5月至2013年5月吉林大學附屬第一醫院胃腸外科收治入院、經病理檢測確診為胃癌的患者10例，術前未行放化療措施。年齡48-71歲，平均年齡57.6歲，男性6例，女性4例。分別選取癌癥病灶組織及相應距病灶>5 cm以上的癌旁組織(視為正常對照組)，所有標本均在術后10 min內置于液氮凍存。

1.2　組織總RNA提取及芯片實驗

運用Trizol法(Invitrogen,USA)提取組織總RNA。用紫外分光管度計(NanoDrop,USA)檢測總RNA濃度及純度，甲醛變性凝膠電泳檢測所提取RNA的完整性，選取符合OD260/OD280值在1.8-2.0之間、條帶完整的RNA樣本進行芯片實驗。調整RNA樣本濃度至1 μg/μl進行逆轉錄，進而進行生物素標記cRNA的合成、純化、片段化，以1μl體積的片段化cRNA進行芯片雜交過程。運用GCOS(GeneChip○ROperating Software)軟件進行芯片掃描，基因芯片顯著性分析(Significant Analysis of Microarray,SAM)法篩選胃癌組織的差異表達基因[5]，篩選改變倍數(fold change,FC)>2,P<0.05為差異基因。實驗過程中所用試劑、儀器均來自Affymetrix(Affymetrix,USA)公司。

1.3　蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction,PPI)網絡的構建及功能注釋

以胃癌中差異表達基因為研究基礎，選取Biological General Repository for Interaction Datasets (BioGRID)在線工具獲取蛋白質-蛋白質相互作用關系。篩選的設定：軟件物種來源限定為Homo sapiens，檢索渠道by gene。運用DAVID數據庫[6]進行GO及Pathway注釋。

2結果

2.1　組織總RNA提取及芯片掃描初始結果

運用Trizol法提取組織總RNA，經紫外分光光度計測得RNA樣本A260/A280比值在1.8-2.0之間，甲醛變性凝膠電泳檢測RNA條帶完整，如圖1所示。將濃度、純度及完整性良好的RNA樣本進行芯片雜交、掃描，所得掃描初始圖如2所示。

2.2　胃癌組織差異基因的表達分析

N：癌旁組織，C：癌癥組織

N：癌旁組織，C：癌癥組織

芯片掃描共得到1666個差異基因(fold change>2，P<0.05)，其中1540個在胃癌組織中呈高表達，126個呈低表達。結果顯示MMP家族多個成員在胃癌組織中均呈高表達狀態，詳細的基因差異表達倍數改變見表1。

2.3　MMPs及其相關分子互作網絡的構建與功能分析

將BioGRID數據庫中分子互作關系與基因芯片結果整合，得到胃癌組織中表達失調的MMPs相關分子互作網絡，如圖3所示，網絡中18基因在胃癌組織中表達活躍(表1所示)。此18個基因參與了重要的生物學過程(GO-BP)及調控通路(Pathway)，如圖4所示。其中富集程度最顯著的GO條目是細胞外基質的分解、細胞外組分分解等生物過程，富集程度最顯著的Pathway條目是ECM-受體的相互作用、黏著斑等通路，以上的生物過程及通路也是與癌癥的侵襲、轉移過程密切相關的[7,8]。

BioGRID中MMPs相關的蛋白質相互作用網絡圖。紅色圓圈為胃癌組織中高表達基因(P<0.05)

圖3胃癌組織中失調的MMPs家族蛋白質-蛋白質

相互作用網絡

A:GO富集; B:Pathway富集。橫坐標為條目顯著性p-value的-log2值，縱坐標為GO及Pathway條目名稱。

GenesFoldChangeLog2FCMMP17.112.83MMP103.501.81MMP124.172.06MMP132.031.02MMP142.641.40MMP22.231.16MMP37.782.96MMP74.922.30ITGA23.031.60LUM4.762.25COL1A14.662.22LCN22.691.43OSBPL102.081.06TGFB12.061.04THBS24.502.17TIMP14.472.16BRCA13.691.43CD442.061.04

Fold Change為基因的差異改變倍數，Log2FC為Fold Change(FC)的log2值。

3討論

細胞外基質是細胞侵襲、轉移的重要屏障成分，基質金屬蛋白酶家族MMPs可以降解細胞基底膜及外基質中蛋白組分，因此促進了惡性腫瘤的浸潤、轉移過程。相關研究報道了MMP1[9],MMP2[10],MMP7[11],MMP11[12]等多個MMPs成員在胃癌及其它癌癥中表達上調。我們通過組織基因掃描發現MMPs多個基因在胃癌組織中呈高表達狀態，其中MMP3及MMP1上調最為明顯(表1)。

分子相互作用網絡分析有助于為疾病的發生發展提供較為系統的分子學機制。BioGRID數據庫提供了已發表文獻證實的和預測的蛋白質相互作用關系，將數據庫中的蛋白互作信息與前期基因芯片的差異表達相結合，得到胃癌組織中存在差異表達的MMPs相關的蛋白互作網絡，網絡中18個分子在胃癌組織中呈高表達狀態，且其參與的主要的分子功能及通路和癌癥的侵襲、轉移過程密切相關，體現了MMPs及相關基因在胃癌發生發展中的重要性。

隨著技術的不斷發展，高通量組學數據及相應的在線軟件、分析工具等為生物醫學提供了廣泛的信息篩選平臺[13]。通過對所選基因的功能及通路注釋，往往能夠得到與疾病的發生發展密切相關的分子學機制，這些信息有助于我們更好的理解已知的基因或者蛋白的作用，也能夠指導研究者尋找出更多未知功能的潛在分子靶標。本文在以上研究思路的指引下，獲得了與胃癌侵襲、轉移過程密切相關的MMPs參與的分子互作網絡，為后續研究提供了較為全面的分子學機制基礎。

參考文獻：

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[13]Ding L,Wendl MC,McMichael JF,et al.Expanding the computational toolbox for mining cancer genomes[J].Nat Rev Genet,2014,15(8):556.

摘要：目的探討MMPs相關分子互作網絡在胃癌組織中的表達情況。方法運用10對胃癌及相應癌旁組織芯片篩選胃癌組織中差異表達基因，結合BioGRID數據庫，構建胃癌組織中表達異常的MMPs相關分子互作網絡。結果胃癌中多個MMPs家族成員及其互作網絡中的18個基因均呈高表達狀態，主要參與的生物學過程及通路和癌癥細胞的侵襲、轉移等過程密切相關。結論高通量組學及相關數據庫、分析工具的結合有助于構建癌癥中表達異常的分子互作網絡，為后續的研究提供較全面的分子學機制基礎。

關鍵詞：分子互作網絡；MMPs；BioGRID數據庫；GO；Pathway

Expression analysis of MMPs and their related genes based on the molecular interaction network in gastric cancer tissuesXUJian-ting,JINHao-fan,WANGJi-han,etal.(CollegeofBasicMedicalSciences,JilinUniversity,Changchun130021,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the expression of MMPs-related molecular interaction network in gastric cancer tissues.Methods10 pairs of gastric cancer and their corresponding para-carcinoma tissues were analyzed with microarray for screening of the differentially expressed genes,then constructed the differentially expressed MMPs-related molecular interaction network in gastric cancer tissues by integrating the information from BioGRID databases and the microarray results.Results18 genes in the MMPs-related molecular interaction network (also including several MMPs members) were up-regulated in gastric cancer tissues,the main biological processes and pathways that they participated in were closely related with cancer invasion and metastasis progression.ConclusionThe combination of high-throughput genomics,bioinformatic databases and analytical tools is necessary for the analysis of cancer-related molecular interaction network,which will provide more comprehensive molecular mechanisms for the future research.

Key words:molecular interaction network;MMPs;BioGRID;GO;Pathway

收稿日期：(2013-12-11)

文獻標識碼：A

中圖分類號：R735.2

文章編號：1007-4287(2015)01-0056-04

通訊作者*