CXCL12/CXCR4在小細胞肺癌患者中的表達及臨床意義

孫牧男，劉　磊，馬寅芙，許淑芬，方艷秋，譚　巖

(吉林省人民醫院 中心實驗室，吉林 長春130021)

CXCL12/CXCR4在小細胞肺癌患者中的表達及臨床意義

孫牧男，劉磊，馬寅芙，許淑芬，方艷秋，譚巖*

(吉林省人民醫院 中心實驗室，吉林 長春130021)

(ChinJLabDiagn,2015,19:0050)

肺癌是嚴重威脅人類健康的常見惡性腫瘤，其中小細胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)是一種惡性程度較高的肺癌[1,2]，在肺癌中所占的比例約20%-25%。小細胞肺癌惡性程度高，倍增時間短，轉移早而廣泛，對化療、放療敏感，初治緩解率高，但極易發生繼發性耐藥，容易復發[3,4]。

CXCL12又稱基質細胞衍生因子-1(SDF-1)是小分子的細胞因子，屬于趨化因子蛋白家族。CXCL12及其受體CXCR4的生理功能主要是介導免疫和炎性反應，近年來研究發現，CXCL12/CXCR4還與多種腫瘤的侵襲和轉移密切相關[5,6]。

本研究通過檢測SCLC患者手術前外周血中CXCL12含量及組織中CXCL12/CXCR4的表達，探討了CXCL12/CXCR4與結直腸癌患者臨床病理特征之間的關系及其在SCLC進展中的作用。

1材料與方法

1.1　研究對象

收集吉林省人民醫院初次住院的SCLC患者62例，其中男性50例、女性12例，年齡42-68歲，平均年齡57歲；局限期(Limited stage disease，LD)患者30例，擴散期(Expensive stage disease，ED)患者32例。所有患者手術前均未接受放療、化療及其他抗腫瘤治療，術后均獲得病理確診。另外選擇10例良性肺部腫瘤患者作為對照組，男性7例、女性3例，年齡35-66歲，平均年齡53歲，均排除各臟器病變，無感染性疾病等。

1.2　標本采集

采用真空干燥采血管分別抽取受檢者手術前清晨空腹靜脈血10 ml和健康志愿者清晨空腹靜脈血10 ml，真空干燥采血管中血樣于室溫下自然凝集30 min，3 500×g 離心15 min，分離血清，置于-20℃冰箱中保存待檢。手術中收集原發性肺癌切除標本，5倍體積RNA later保存于-80℃冰箱。

1.3　試劑和儀器

人基質細胞衍生因子1β(SDF-1β/CXCL12)ELISA試劑盒購于北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；M-MLV逆轉錄試劑盒購于Promega公司；實時熒光定量PCR試劑盒購于寶生物工程有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購于碧云天生物技術公司；RNA later保存液購于美國安捷倫公司；鼠抗人CXCL12、CXCR4抗體及兔抗鼠二抗均購于Sant Cruz公司。

1.4　方法

1.4.1ELISA 方法檢測SCLC患者血清CXCL12水平，嚴格按照CXCL12檢測試劑盒說明書提供的方法，向96孔板中分別加入CXCL12抗體，密封4℃過夜，次日用洗滌緩沖液洗滌3次，封閉液封閉后向孔板中先加樣品稀釋液40 μl，然后再加待測樣品10 μl，室溫下孵育后用CXCL12抗體檢測，洗滌后加入酶標試劑50 μl，室溫下孵育45 min，洗滌后加入顯色液，避光顯色15 min，加終止液后測定A450值。同時收集10名健康人血清作為對照。

1.4.2RT-PCR和Westernblot方法檢測CXCL12/CXCR4表達水平 TRIZOL法提取組織中RNA，用M-MLV逆轉錄酶進行逆轉錄，PCR擴增CXCL12和CXCR4，同時擴增GAPDH作為內參物。CXCL12引物序列為：上游引物5’-CCGCGCTCTGCCTCAGCGACGGGAAG-3’,下游引物5’-CTTGTTTAAAGCTTTCTCCAGGTACT-3’；CXCR4引物序列為：上游引物5’-AGCTGTTGGTGAAAAGGTGGTCTATG-3’,下游引物5’-GCGCTTCTGGTGGCCCTTGGAGTGTG-3’；GAPDH引物序列為：上游引物5’-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3’,下游引物5’-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3’。將同樣大小肺癌組織及良性對照組織勻漿，細胞裂解液冰上裂解30 min，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，以每孔80 μg蛋白質樣品進行SDS-PAGE電泳、轉膜，用CXCL12、CXCR4一抗4℃孵育過夜，加入相應的辣根過氧化物沒標記的二抗室溫孵育1 h，DAB顯色。

1.5　統計學方法

應用SPSS 13.0統計軟件對結果進行分析，所有檢測結果均以 Mean ± SD表示，P<0.05 為差異有統計學意義。

2結果

2.1SCLC患者血清CXCL12水平的變化ELISA檢測結果顯示，62例SCLC患者血清中CXCL12水平均明顯高于健康對照組，同時擴散期患者血清中CXCL12含量也高于局限期患者血清中的含量。差異具有統計學意義(P<0.01)，見圖1。

圖1采用酶聯免疫吸附試驗檢測不同分期SCLC患者和健康對照組血清中CXCL12的含量

2.2ELISA檢測血清中CXCL12與SCLC患者病理特征的關系 實驗結果顯示，CXCL12的表達水平與腫瘤大小及淋巴結轉移密切相關(P<0.01)，與患者年齡和性別之間的關系無統計學意義(P>0.05)，見表1)。

表1　SCLC患者及正常對照組臨床資料分析

*：與對照組相比具有統計學差異，P<0.01。△：SCLC組內相比具有統計學差異，P<0.01。

2.3SCLC患者組織中CXCL12和CXCR4表達水平Real-time PCR和Westernblot結果顯示，62例SCLC患者肺癌組織中CXCL12和CXCR4在轉錄水平和表達水平均明顯高于對照組，差異具有統計學意義(P<0.01)，見圖2。

圖2采用Real-time PCR和Westernblot方法分別檢測不同分期SCLC患者和對照組組織中CXCL12、CXCR4的表達水平。

3討論

CXCL12 基因定位于人 10 號染色體長臂，能與CXCR4的N端特異性結合，并與CXCR4結合后形成CXCL12/CXCR4生物軸，進而啟動下游信號通路，在維持胚胎發育、介導免疫及炎癥反應、調控造血、誘導血管生成、腫瘤侵襲轉移等多種生理病理過程中發揮重要作用[7,8]。大量研究表明，CXCL12與CXCR4結合可以調節多種腫瘤細胞增殖，包括乳腺癌、前列腺癌、胃癌、惡性黑色素瘤、膀胱癌、食管癌、結直腸癌以及尤文肉瘤等[9- 16]。

本研究檢測了SCLC患者血清和組織中CXCL12/CXCR4的表達水平，結果顯示，與對照組比較，SCLC患者血清中CXCL12水平明顯上升，并且擴散期SCLC患者與局限期SCLC患者相比具有更高水平的CXCL12。同時，患者血清中CXCL12的表達還與腫瘤的大小及淋巴結轉移明顯相關，這表明，CXCL12/CXCR4可能直接參與了SCLC的發生、轉移和侵襲，加劇了腫瘤的病理進展，這可能與CXCL12/CXCR4相關的信號通路相關。

CXCL12/CXCR4通路介導腫瘤細胞增殖是通過多種信號傳導實現的。CXCL12/CXCR4可以改變G蛋白的化學結構，進而激活應激活化蛋白激酶/JNK信號通路(stress activated protein kinase/Jun-N terminal kinases，SAPK/JNK)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)和細胞外信號調節激酶1/2(extracellular regulated kinase 1/2，ERK1/2)通路[17-19]。Carmo等[20]發現CXCL12/CXCR4可以活化PI3K/Akt信號通路誘導膠質瘤細胞的增殖和轉移，再者，CXCL12可以通過自分泌和旁分泌方式誘導腫瘤細胞增殖[22]。因此CXCL12/CXCR4表達失調會導致某些自主細胞增殖和細胞惡性轉化，這可能介導了肺癌的惡性發展。

隨著對CXCL12及其他趨化因子家族的不斷研究，其在多種免疫病以及腫瘤中的作用得到越來越廣泛的認可。本研究提示CXCL12可以作為提示小細胞肺癌進程的重要分子標記，但是其調節作用的具體機制還需進一步探討。

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摘要：目的研究小細胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)患者外周血中CXCL12及其受體CXCR4的表達情況，探討CXCL12/CXCR4與SCLC發生和發展之間的關系。方法采用ELISA、real-time PCR和Westernblot方法，檢測CXCL12與CXCR4在30例局限期(Limited stage disease，LD)SCLC患者、32例擴散期(Expensive stage disease，ED)SCLC患者和10例良性肺部腫瘤患者(對照組，Control)中的轉錄水平和表達水平，分析CXCL12、CXCR4與SCLC患者臨床病理等指標之間的關系。結果CXCL12、CXCR4在SCLC患者組織中均高表達，其中擴散期患者CXCL12、CXCR4表達平略高于局限期患者組。擴散期患者外周血中CXCL12表達高于其在局限期患者中的水平，二者均高于對照組。血清中CXCL12水平與患者的性別和年齡無關(P>0.05)，而與腫瘤的大小及淋巴結轉移明顯相關(P<0.01)。結論CXCL12/CXCR4可能直接或間接參與對SCLC發生和發展的調控。

關鍵詞：肺癌；CXCL12；CXCR4

Expression of CXCL12/CXCR4 cells in small cell lung cancer and their clinical significanceSUNMu-nan,LIULei,MAYin-fu,etal.(CentralLaboratory,thePeople’sHospitalofJilinProvince,Changchun130021,China)

Abstract:ObjectiveTo study the expression levels of CXCL12 and CXCR4 in patients with small cell lung cancer (SCLC),and to investigate the correlation between CXCL12/CXCR4 and the development of human SCLC.MethodsThe serum concentration of CXCL12 was detected by ELISA,and the expression of CXCL12/CXCR4 in tissues were detected by real-time PCR and Westernblot respectively in 30 SCLC patients in limited stage,32 SCLC patients in extensive stage and 10 benign lung cancers (control).Then we analyzed the correlation between CXCL12/CXCR4 and clinical pathological characteristics of SCLC.ResultsThe concentration of serum CXCL12 was higher in patients with limited stage than that in patients with extensive stage,both of them were showed a higher level than that in HC.The expressions of CXCL12/CXCR4 were also higher in SCLC patients than that in HC as well.The serum level of CXCL12 was associated with tumor size and lymphatic metastasis (P<0.01) and had no relations with sex or age of patients (P>0.05).ConclusionThe expression of CXCL12/CXCR4 may participate in regulating the development of SCLC.

Key words:small cell lung cancer; CXCL12; CXCR4

收稿日期：(2013-12-26)

作者簡介：孫牧男(1983-)，女，碩士研究生，技師，主要研究方向為腫瘤生物學治療。

文獻標識碼：A

中圖分類號：R734.2

文章編號：1007-4287(2015)01-0050-04

通訊作者*