實時熒光定量聚合酶鏈反應技術對結核性腦膜炎的診斷價值

楊　柳，蘇明權，馬越云，辛毅娟，韓若冰，張　榮，文　靜，郝曉柯

(第四軍醫大學西京醫院 全軍醫學檢驗中心，陜西 西安710032)

實時熒光定量聚合酶鏈反應技術對結核性腦膜炎的診斷價值

楊柳，蘇明權，馬越云，辛毅娟，韓若冰，張榮，文靜，郝曉柯*

(第四軍醫大學西京醫院 全軍醫學檢驗中心，陜西 西安710032)

(ChinJLabDiagn,2015,19:0035)

結核性腦膜炎是結核病中最常見的病種，主要是由于結核分枝桿菌侵入到蛛網膜下隙，繼而引起軟腦膜、蛛網膜并累及腦神經和腦實質等的非化膿性炎癥[1]。目前對結核性腦膜炎的診斷主要根據病史、癥狀及體征、腦脊液的實驗室檢查等綜合評估而作出診斷。但研究顯示,結核性腦膜炎的臨床表現和實驗室檢查并不典型，因而對結核性腦膜炎的診斷常出現漏診和誤診，進而延誤對患者病情的救治[2]。因此，快速、有效地檢測結核分枝桿菌并作出臨床診斷是有效改善患者病情的重要手段[3]。本研究采用涂片、實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RT-PCR)技術對神經系統類疾病的腦脊液標本進行結核性分枝桿菌檢測，并對檢測結果進行比較分析，以期為指導臨床診斷結核性腦膜炎提供參考。

1資料與方法

1.1　一般資料

選取2010年5月—2013年5月我院神經內科門診和感染科門診收治的57例結核性腦膜炎患者、105例疑似結核性腦膜炎患者和120例非結核性腦膜炎患者為研究對象。其中結核性腦膜炎67例，男37例，女30例，年齡18-71歲，平均(35.7±12.6)歲；疑似結核性腦膜炎105例，男63例，女42例，年齡21-70歲，平均(36.2±13.1)歲，其中癲癇11例，腦炎35例，腦積水13例，腦梗死15例，嗜睡6例，顱內感染10例，脊髓病變8例，其他如抽搐、四肢無力等5例；非結核性腦膜炎120例，男69例，女51例，年齡19-72歲，平均(36.8±11.5)歲，其中病毒性腦膜炎56例，新型隱球菌腦膜炎19例，化膿性腦膜炎45例。

結核性腦膜炎的診斷標準[4]：①在急性或者亞急性腦膜炎基礎上，經腦脊液檢查有結核菌存在，或者皮膚結核菌素試驗顯示為陽性；②患者血、腦脊液經細胞學檢查均為陰性；③存活病例經抗結核治療后好轉或痊愈。

1.2　方法

1.2.1涂片法對入院后的患者行腰椎穿刺，并抽取部分腦脊液標本留待后用。取腦脊液標本1 ml，在3 000 r/min的轉速下離心15 min，保留離心后的沉渣進行涂片和固定，并進行抗酸染色，最后在顯微鏡視野下觀察結核桿菌。整個過程嚴格按照《結核病細菌學檢驗規程》進行。抗酸染色劑由珠海貝索生物技術有限公司提供。

1.2.2RT-PCR法將抽取的非血性腦脊液標本中的1 ml置于1.5 ml的無菌離心管中，在1 4000 r/min轉速下離心10 min，然后將1 ml無菌生理鹽水加入到離心棄去上清液的沉淀中，同時振蕩使之均勻懸浮，將沉淀留待后用。將抽取的血性腦脊液1 ml置于1.5 ml的無菌離心管中，在14 000 r/min轉速下離心10 min，然后將1 ml無菌去離子水加入到棄去上清液的沉淀中，并反復洗滌溶液使紅細胞被洗掉，最后留下沉淀以備后用。分別在兩種沉淀中加入50 μl DNA提取液，并將其振蕩以混合均勻，然后將其置于100℃的金屬浴中，10 min后，在14 000 r/min轉速下離心10 min，取離心后的上清液2 μl并將其置于到聚合酶鏈反應的試管內。最后進行循環反應，步驟為：在92℃條件下進行預變性，2 min后按照93℃的環境45 s，然后在55℃的環境50 s進行10個循環，循環完成后，再按照93℃的環境30 s，55℃的環境45 s進行30個循環。結果的判斷標準：循環閾值(cycle threshold,Ct)<30且曲線是標準的S形，結果計為陽性；如果Ct沒有出現數值，則結果計為陰性。其中RT-PCR的檢測試劑為結核分枝桿菌核酸檢測試劑盒(中山大學達安基因股份有限公司提供)，檢測儀器為美國ABI-7500實時熒光定量PCR儀。

1.3　統計學處理

采用SPSS 19.0軟件進行數據錄入和統計分析，計數資料描述采用率(%)，比較采用χ2檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1　三組患者腦脊液涂片和RT-PCR法檢測結果比較

涂片法檢測發現10例陽性，其中結核性腦膜炎7例(70.00%)，疑似結核性腦膜炎3例(30.00%)；RT-PCR法檢測發現46例陽性，其中結核性腦膜炎31例(67.39%)，疑似結核性腦膜炎15例(32.61%)。在結核性腦膜炎患者的檢測中，涂片法陽性率為12.28%，RT-PCR法陽性率為54.39%，涂片法陽性率低于RT-PCR法，差異有統計學意義(P<0.05)；在疑似結核性腦膜炎患者的檢測中，涂片法陽性率為2.91%，RT-PCR法陽性率為14.56%，涂片法檢測的陽性率低于RT-PCR法的陽性率，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1　三組患者腦脊液涂片法和RT-PCR法檢測結果比較　例

2.2　兩種檢測方法的診斷價值

腦脊液涂片法檢測結核性腦膜炎的靈敏度為12.28%，漏診率為87.72%，特異度為100%；RT-PCR法檢測的靈敏度為54.39%，漏診率為45.61%，特異度為100%，RT-PCR法的靈敏度高于涂片法，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2　兩種方法在結核性腦膜炎患者中的診斷價值

注：※與涂片法比較，P<0.05。

3討論

結核性腦膜炎是臨床常見的嚴重的肺外結核病，具有病死率高和致殘率高等特點，嚴重地威脅著患者的健康和生命質量。結核性腦膜炎由于不典型的臨床表現和實驗室檢查，常常延誤對病情的診治而導致患者的預后較差，因而，早期準確的診斷和及時有效的治療是改善患者病情和提高臨床預后最有效的手段[5]。目前，臨床上對結核性腦膜炎最有效的診斷方法是在腦脊液中檢出結核分枝桿菌，傳統的診斷結核性腦膜炎的方法是涂片法，即對結核桿菌進行培養并對標本涂片檢測。涂片法因為具有簡便、快速等特點而廣受臨床醫生的關注，但有報道顯示涂片法的靈敏度低，特異度差，同時也不能將死菌和活菌區分開來[6]。隨著醫學技術的不斷發展，RT-PCR法因為方法學方面的優越性而逐漸用于基因表達、病原體檢測等研究領域[7]。該方法具有以下優點：①在常規的PCR法基礎上，RT-PCR法加入了熒光探針，從而將核酸擴增、雜交以及光譜技術巧妙地融合在一起；②RT-PCR法不需要將管蓋打開，因而對實驗室造成PCR產物的污染；③RT-PCR法的整個過程和結果均由計算機操作，因此簡單快速；④靈敏度高、重現性好，同時還能根據每個樣本Ct值而獲得標準的S形曲線；⑤通過實時監測RT-PCR法的整個過程，解決了傳統方法中只能對終點進行定量檢測的缺陷。

查閱國內相關文獻發現，關于涂片法和RT-PCR法檢測結核性腦膜炎的診斷價值比較的文獻還很少。本研究采用兩種方法分別對結核性腦膜炎、疑似結核性腦膜炎和非結核性腦膜炎患者的腦脊液標本進行檢測，結果發現，在結核性腦膜炎患者的檢測中，涂片法陽性率為12.28%，RT-PCR法的陽性率為67.39%，與唐神結等人[8]的研究結果相似，并且涂片法陽性率低于RT-PCR法，差異有統計學意義。而在疑似結核性腦膜炎患者的檢測中，涂片法陽性率為2.91%，RT-PCR法陽性率為14.56%，差異有統計學意義。提示我們RT-PCR法作為檢測結核性腦膜炎的方法診斷價值較高。結果還顯示，腦脊液涂片法檢測結核性腦膜炎的靈敏度為12.28%，漏診率為87.72%，說明傳統方法檢測結核性腦膜炎的靈敏度較低，與有關研究結果一致[9]。RT-PCR法檢測的靈敏度為54.39%，高于涂片法的靈敏度，差異有統計學意義，與有關研究結果一致[10]，提示我們RT-PCR法檢測結核性腦膜炎的靈敏度高。因此，如果患者出現結核性腦膜炎的明顯臨床癥狀和體征時，建議早期且持續地進行腦脊液結核分枝桿菌檢測具有重要的臨床價值。但是本研究中RT-PCR法的陽性率低于其他研究報道[11]，可能原因是：①患者進行了抗結核治療，導致在檢測過程中出現了低陽性率；②由于對腦脊液標本中的結核分枝桿菌DNA的拷貝數量較低，繼而沒有達到試劑檢測的下限，因此，檢測結果可能顯示為陰性；③在腦脊液標本采集過程中，有部分沉渣可能存在剝脫現象，因而可能引起結果檢出率的下降。

參考文獻：

[1]謝本維,郭曉東,杜翔,等.西藏64例結核性腦膜炎臨床分析[J].現代生物醫學進展,2013,13(10):1952,1970.

[2]楊笑,吳若芬,孔繁元,等.結核性腦膜炎臨床及腦脊液細胞學分析[J].中國現代神經疾病雜志,2012,12(2):198.

[3]陳卓,李曉民,劉艷,等.腦脊液細胞學對結核性腦膜炎的診斷價值[J].中華全科醫學,2013,11(4):578.

[4]Gupta BK,Bharat V,Bandyopadhyay D,et al.Role of cerebrospinal fluid adenosine deaminase level estimation in diagnosis of tuberculous meningitis[J].J Indian Med Assoc,2013,111(9): 603,608.

[5]楊學謹.結核性腦膜炎的臨床診治[J].臨床醫學,2014,34(5):47.

[6]閆世明,秦桂香,趙云虹,等.結核性腦膜炎腦脊液細胞學的臨床研究[J].中國防癆雜志,2011,33(12):780.

[7]崔帷,杜可周,關玲,等.實時熒光定量PCR技術在結核性腦膜炎早期診斷中的應用[J].中國實用神經疾病雜志,2013,16(23):104.

[8]唐神結,高文.臨床結核病學[M].北京:人民衛生出版社,2011:402-417.

[9]Pasco PM.Diagnosis features of tuberculous meningitis:a cross-sectional study[J].BMC Res Notes,2012,5:49.

[10]吳睿彥,陳志成,肖芃,等.結核分枝桿菌熒光定量聚合酶鏈反應對結核性腦膜炎的早期診斷價值[J].實用醫學雜志,2012,28(17):2867.

[11]馮恩航,王冬梅,楊文碧,等.熒光定量PCR方法檢測腦脊液中結核菌DNA的臨床意義[J].黑龍江醫學,2011,35(4):282.

摘要：目的探討實時熒光定量聚合酶鏈反應技術(RT-PCR)對結核性腦膜炎的診斷價值。方法分別采用涂片法、RT-PCR法對結核性腦膜炎、疑似結核性腦膜炎以及非結核性腦膜炎患者的腦脊液標本進行檢測，并對檢測結果進行比較分析。結果涂片法共檢出10例陽性，其中結核性腦膜炎7例(70.00%)，疑似結核性腦膜炎3例(30.00%)；RT-PCR法共檢出46例陽性，其中結核性腦膜炎31例(67.39%)，疑似結核性腦膜炎15例(32.61%)。對結核性腦膜炎患者檢測，涂片法陽性率(12.28%)低于RT-PCR法陽性率(54.39%)，差異有統計學意義(P<0.05)；對疑似結核性腦膜炎患者檢測，涂片法陽性率(2.91%)低于RT-PCR法陽性率(14.56%)，差異有統計學意義(P<0.05)；腦脊液涂片法檢測結核性腦膜炎的靈敏度為12.28%，漏診率為87.72%，RT-PCR法檢測的靈敏度為54.39%，漏診率為45.61%，差異有統計學意義(P<0.05)。結論RT-PCR法診斷結核性腦膜炎具有靈敏度好，準確度高等特點，臨床有重要的指導意義。

關鍵詞：結核性腦膜炎；腦脊液；實時熒光定量聚合酶鏈反應技術；診斷價值

The diagnosis value of real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction in tuberculous meningitisYANGLiu，SUMing-quan，MAYue-yun，etal.(InspectionArmyMedicalCenter,XijingHospitalofTheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xian,Shanxi,710032)

Abstract:ObjectiveTo investigate the diagnosis value of real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction(TR-PCR) in tuberculous meningitis.MethodsThe cerebrospinal fluid specimens of patients with tuberculous meningitis,suspected tuberculous meningitis and non-tuberculous meningitis were detected by using smear method and RT-PCR respectively,and the testing?results were compared and analyzed.ResultsThere were 10 cases of positive by smear method,including 7 cases of tuberculous meningitis(70.00%) and 3 cases of suspected tuberculous meningitis(30.00%);while 46 cases of positive by TR-PCR method,including 31 cases of tuberculous meningitis(67.39%) and 15 cases of suspected tuberculous meningitis(32.61%).In detection of patients with tuberculous meningitis,the positive rate by smear method was 12.28%,which was lower than 54.39% by RT-PCR method,the difference was statistically significance(P<0.05).In detection of patients with suspected tuberculous meningitis,the positive rate in smear method was 2.91%,which was lower than 14.56% in RT-PCR method,the difference was statistically significance(P<0.05).The sensitivity of smear method in detecting tuberculous meningitis was 12.28%,and the rate of missed diagnosis was 87.72%,while the RT-PCR was 54.39% and 45.61% respectively,the sensitivity of TR-PCR was higher than that of smear method,the difference was statistically significance(P<0.05).ConclusionRT-PCR in diagnosis of tuberculous meningitis has a characteristic of good sensitivity,high accuracy,and it has an important clinical significance.

Key words:Tuberculous meningitis;cerebrospinal fluid;real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction;Diagnosis value

收稿日期：(2013-12-24)

作者簡介：楊柳(1978-)，女，碩士，主治醫師、講師，從事分子生物學診斷方面的研究；郝曉柯(1959-)，男，博士，主任醫師、教授，從事檢驗診斷學方面的研究。

文獻標識碼：A

中圖分類號：R529.3

文章編號：1007-4287(2015)01-0035-04

通訊作者*