miR-9在骨肉瘤中的表達(dá)及臨床相關(guān)性探討

miR-9在骨肉瘤中的表達(dá)及臨床相關(guān)性探討

尤建宇，王文軍，張寧，劉波，趙寶林*

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 骨科，吉林 長(zhǎng)春130033)

骨肉瘤好發(fā)于青少年，約占所有惡性骨腫瘤的35%[1].傳統(tǒng)治療方法雖然能有效的提高骨肉瘤患者的術(shù)后生存率，但是仍有部分患者發(fā)生肺部轉(zhuǎn)移。miRNA是一種長(zhǎng)度約為22bp的非編碼單鏈RNA,它與靶基因3’端互補(bǔ)配對(duì)，降解或抑制靶基因表達(dá)，從而影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡等病理過程[2-4]。已有研究表明miR-9在喉鱗癌、鼻咽癌、卵巢癌等腫瘤細(xì)胞中呈低表達(dá)水平[5-7]，但它在骨肉瘤的表達(dá)與臨床病理學(xué)關(guān)系卻鮮有報(bào)道。本研究檢測(cè)了miR-9 在骨肉瘤組織中的表達(dá)水平，并分析其表達(dá)與臨床病理學(xué)之間的關(guān)系。

1材料與方法

1.1骨肉瘤組織的來源選擇2011年9月到2013年6月在吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院的32例骨肉瘤患者。選取標(biāo)準(zhǔn)如下：①臨床病理學(xué)檢查和影像學(xué)證實(shí)為骨肉瘤；②均為原發(fā)于四肢的骨肉瘤，無一例在術(shù)前行化學(xué)或者放射治療。切取骨肉瘤組織和癌旁正常組織為實(shí)驗(yàn)樣本，即刻放入液氮中保存，隨后保存于-80℃冰箱。

1.2主要試劑RNA提取所需TRLzol reagent以及電泳所需瓊脂糖購自Invitrogen公司、DNA提取試劑盒。qPCR逆轉(zhuǎn)錄、SYBR Premix Ex TaqⅡ、引物、SYBR○RPrimeScript○RmiRNA RT-PCR Kit (Perfect Real Time)試劑盒均購自上海吉瑪公司。

1.3RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄根據(jù)TRLzol reagent(Invitrogen)說明書抽提RNA，用紫外分光光度計(jì)監(jiān)測(cè)A260/A280比值，并檢測(cè)RNA的純度和濃度，使用吉瑪試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR。

1.4miRNA靶基因信息學(xué)預(yù)測(cè)使用Star Base 2.0、DIANA LAB和PicTar進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，分類匯總miRNA-9的潛在靶基因，2以上的網(wǎng)站預(yù)測(cè)的靶基因認(rèn)為是其可能靶基因。

1.5qRT-PCR驗(yàn)證表達(dá)水平差異較大的miRNA將1 000 ng RNA加入20 μl逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，RT-PCR儀驗(yàn)證差異表達(dá)的miRNA和靶基因，U6作為實(shí)驗(yàn)內(nèi)參，GAPDH引物序列：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′和5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；擴(kuò)增條件：95℃變性30 s，95℃變性25 s，60℃退火延伸25 s，50個(gè)循環(huán)。hsa-miR-9引物的序列：5′-TCTTTG GTTATCTAGCTGTATGA-3′。擴(kuò)增條件：95℃變性30 s，95℃變性20 s，60℃退火延伸30 s，45個(gè)循環(huán)。SRPK-1引物序列：5′-CACGGCATGCATGGCCTTTGA-3′和5′-CGGCGGCAGTGGCTCTCTTC-3′。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算。兩組計(jì)量資料使用非獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，使用方差分析多組計(jì)量資料,P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用Origin7.5軟件繪制數(shù)據(jù)圖形。

2結(jié)果

2.1miR-9擴(kuò)增曲線圓滑，為單峰型，顯示為特異性擴(kuò)增。融解曲線的特異性也較好(如圖1所示)。

圖1　miR-9的擴(kuò)增曲線及其融解曲線

2.2　miR-9在骨肉瘤和癌旁正常骨組織中的表達(dá)水平

miR-9在骨肉瘤和癌旁正常骨組織中均有表達(dá)，與癌旁正常骨組織相比，miR-9在骨肉瘤組織的表達(dá)水平呈降低趨勢(shì)(如圖2，P<0.05)；

圖2　miR-9在骨肉瘤組織和癌旁正常骨組織中的表達(dá)水平

2.3　miR-9在骨肉瘤中的表達(dá)水平和臨床病理學(xué)關(guān)系

根據(jù) miR-9表達(dá)的中位值,骨肉瘤患者被分為兩組:低表達(dá)組(n=18)和高表達(dá)組(n=14)。miR-9與骨肉瘤患者的年齡、性別、腫瘤分型和分期無顯著關(guān)系(P>0.05)。 (如表1)。

2.4　RT-PCR法檢測(cè)SRPK-1 mRNA在骨肉瘤組織和癌旁正常骨組織中的表達(dá)水平

實(shí)驗(yàn)表明SRPK-1 mRNA的表達(dá)水平在骨肉瘤組織和癌旁正常骨組織沒 有顯著差異(如圖3,P>0.05)

2.5　雙變量相關(guān)性分析miR-9和SRPK-1在骨肉瘤中的表達(dá)關(guān)系

Spearman 雙變量相關(guān)性分析顯示SRPK-1與miR-9呈顯著的負(fù)相關(guān)(r=-0.973,如圖4，P<0.05)。

表1　miR-9表達(dá)與骨肉瘤患者的年齡、性別、腫瘤分型和

圖3　SRPK-1 mRNA在骨肉瘤組織和癌旁正常骨組織中

圖4　雙變量相關(guān)性分析miR-9和SRPK-1在骨肉瘤中的

3討論

研究表明[8，9]miRNA的表達(dá)譜在腫瘤組織和癌旁正常組織之間存在差異表達(dá),然而，不同個(gè)體的相同組織間表達(dá)水平卻趨于一致。所以，比較miRNA在腫瘤實(shí)體組織和癌旁組織之間的表達(dá)水平差異,可能有助于找到診斷腫瘤的分子標(biāo)志物[10-11]。

miR-9在多種惡性腫瘤中呈低表達(dá)水平，本研究發(fā)現(xiàn)miR-9在骨肉瘤組織和癌旁正常組織中存在顯著的差異表達(dá)，而且miR-9在骨肉瘤組織中呈低表達(dá),與之前研究較一致[4-6]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)miR-9在原發(fā)骨腫瘤中比轉(zhuǎn)移腫瘤具有較高的水平,表明miR-9可能參與骨肉瘤的轉(zhuǎn)移和進(jìn)展。

本實(shí)驗(yàn)首次分析骨肉瘤組織及癌旁正常骨組織中miR-9的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)84.4%的骨肉瘤患者組織中miR-9表達(dá)下調(diào)。說明 miR-9低表達(dá)可以作為骨肉瘤的診斷指標(biāo)；而SRPK-1蛋白與 miR-9表達(dá)的負(fù)相關(guān)則提示SRPK-1可能是miR-9的調(diào)控靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Broadhead ML,Clark JC,Myers DE,et al.The molecular pathogenesis of osteosarcoma:a review[J].Sarcoma,2011,2011,20:959.

[2]ZENG Y.Principles of micro-RNA production and maturation[J].Oncogene,2006,25(46):6156.

[3]Volk N,Shomron N.Versatility of microRNA biogenesis[J].PLoS One,2011,6(5):19391.

[4]Sayed D,Abdellatif M.MicroRNAs in development and disease[J].Physiol Rev,2011,91(3):827.

[5]Minor J,Wang X,Zhang F,Methylation of microRNA-9 is a specific and sensitive biomarker for oral and oropharyngeal squamous cellcarcinomas[J].Oral Oncol,2012，48(1):73.

[6]Gao F,Zhao ZL,Zhao WT,miR-9 modulates the expression of interferon-regulated genes and MHC class I molecules in human nasopharyngeal carcinoma cells.Biochem Biophys Res Commun[J].2013，431(3):610.

[7]Hu Y,Correa AM,Hoque A,Prognostic significance of differentially expressed miRNAs in esophageal cancer[J].Int J Cancer,2011,128(1):132.

[8]Novello C,Pazzaglia L,Cingolani C,et al.miRNA expression profile in human osteosarcoma:Role of miR-1 and miR-133b in proliferation and cell cycle control[J].Int J Oncol,2013,42:667.

[9]Jones KB,Salah Z,Del Mare S,et al.miRNA signatures associate with pathogenesis and progression of osteosarcoma[J].Cancer Res,2012,72:1865.

[10]Nikifomva MN，Tseng GC，Steward D，et al．MicroRNA expressionprofiling of thyroid tumors：biological significance and diagnosticutility[J]．J Clin Endocrinol Metab,2008,93(5):1600．

[11]Cho WC.OncomiRs:the discovery and progress of microRNAs incancers[J].Mol Cancer,2007,6:60.

收稿日期：(2014-01-23)

文章編號(hào)：1007-4287(2015)01-0027-03

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