利巴韋林對hep-2細胞的放療增敏作用觀察

利巴韋林對hep-2細胞的放療增敏作用觀察

朱飛,李鴻燕,趙明,陳鷗*

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院,吉林 長春130041)

近年來喉癌的治療越來越注意保留喉功能，放射治療的重要性逐漸增加[1],而放療抵抗則是難以回避的問題，放療增敏成為新的任務(wù)。很多人類腫瘤組織尤其是喉癌中發(fā)現(xiàn)了翻譯起始因子4E(eIF4E)，它的過度表達被認為和疾病進展密切相關(guān)[2]，可以作為放療增敏的新靶點[3]。利巴韋林是一種廣泛應(yīng)用的抗病毒藥物，在現(xiàn)今臨床實驗中被發(fā)現(xiàn)可以抑制eif4e[4]。本文是以人喉癌細胞系 Hep-2 為對象，研究利巴韋林對其放療敏感性的影響，以初步探究利巴韋林能否作為一種新的放療增敏藥物。

1材料與方法

1.1　細胞株

人喉癌細胞系 Hep-2，由吉林大學(xué)第二醫(yī)院耳鼻喉科實驗室提供，復(fù)蘇后傳代培養(yǎng)。

1.2　藥物、試劑及儀器

注射用利巴韋林，粉劑，0.25 g一支，品牌名為奇力清。

RPMI-1640 培養(yǎng)基、PBS緩沖液、10%胎牛血清、0.25%胰蛋白酶均購自hyclone公司；碘化丙錠(PI )及 AnnexinV-FITC 試劑盒購自天津三箭生物技術(shù)有限公司X線治療機由吉大二院放療科提供；流式細胞儀由吉大二院中心實驗室提供。

1.3　試驗方法

1.3.1細胞培養(yǎng)人喉癌細胞 Hep-2 置于含 10% 胎牛血清 RPMI-1640 培養(yǎng)液中貼壁培養(yǎng)，于 37℃ 5%CO2孵箱中孵育，常規(guī)傳代換液。

1.3.2細胞分組取對數(shù)期生長的 Hep-2細胞按 1 ×105個/ml胞接種于A、B 2個 6孔培養(yǎng)板，A板對照組，B板放療組，每個板4個孔，37℃ 5% CO2孵箱中孵育 24 h。換液后加入加入利巴韋林PBS溶液，使AB兩板各孔利巴韋林濃度依次為：0 mg/L，2 mg/L，4 mg/L，8 mg/L，放入孵箱孵育24H。B 板室溫下6MV-X 線單次照射，照射條件為：源皮距(SSD) 75 cm，照射野為12.5×8.5 cm，A板不予照射，換液后兩板繼續(xù)孵育24H。

1.3.3消化收集細胞前觀察顯微鏡下AB兩板細胞形態(tài)變化。

1.3.4收集細胞及流式細胞檢測凋亡。以胰蛋白酶消化收集細胞，并以冷PBS清洗2遍，800 r/min離心8 min，棄去上清。遵細胞凋亡檢測試劑盒說明，以1 ml1Xbuffer重懸細胞，300 g離心3 min，棄去上清后加入1 ml1Xbuffer重懸細胞。然后取其100 μl細胞加入標記好的EP管，加入AnnexinV-FITC 及PI 5 μl避光孵育15 min，加入PBS至500 μl后混勻細胞；400 目篩網(wǎng)濾過后上機分析。流式細胞儀散點圖中AnnexinV(+)/PI(-)代表早期凋亡細胞，即C4象限。以C4象限細胞比率記錄為各組細胞的凋亡率。

1.3.5重復(fù)實驗3次，結(jié)果取均值。

1.4　數(shù)據(jù)分析

實驗所得數(shù)據(jù)應(yīng)用 SPSS16.0軟件進行分析，假設(shè)檢驗的顯著性水平取α=0.05。

2結(jié)果

2.1A組各孔細胞貼壁生長尚可，細胞多數(shù)呈梭形或多角形，形態(tài)及大小尚均一，生長致密，偶有懸浮顆粒。B組各孔細胞形態(tài)不均，部分細胞變大，間距稀疏，可見核碎裂象，懸浮顆粒較多(圖1)。

A組B組

圖120倍光鏡下各培養(yǎng)板細胞形態(tài)

2.2流式細胞儀檢測細胞凋亡結(jié)果見表1。

表1　各孔細胞凋亡率比較

A組間4孔比較差異不明顯(P>0.05)。AB組各孔比較差異顯著(P<0.05)。B組組間其他各孔凋亡率同(7.45.0±0.45)%比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，并且隨著利巴韋林濃度升高，hep-2細胞凋亡增加。見圖2。

A組流式細胞圖

B組流式細胞圖

3討論

喉癌是喉部常見的惡性腫瘤，主要為鱗癌，好發(fā)于聲門或聲門上區(qū)，在耳鼻咽喉惡性腫瘤中占11%-22%[5]。近年來，喉癌的治療對保留喉功能愈發(fā)重視，放射治療的地位愈加重要。但喉癌對放療敏感性低，常出現(xiàn)對放療不敏感導(dǎo)致放療抵抗，或者大劑量放射治療后引發(fā)喉軟骨炎、喉水腫、喉軟骨壞死等不良反應(yīng)[6]，因此需要新的策略提高喉癌的放療敏感性。尋找高效安全的放療增敏劑是放療增敏研究的新熱點。理想的放射增敏劑應(yīng)能顯著增加腫瘤細胞的放療療效，而對正常組織沒有或很小有毒副反應(yīng)[7]。

研究表明，真核細胞翻譯起始因子eiF4e可以作為放療增敏的一個靶點[8]。eIF4e在喉癌組織中高表達，顯著地改變了細胞表型，可促進細胞增殖和誘導(dǎo)細胞轉(zhuǎn)化、腫瘤形成和轉(zhuǎn)移，影響VEGF及bFGF表達，影響腫瘤血管生成[9]。利巴韋林是目前臨床實驗中eiF4e的直接抑制劑，在急性髓系白血病的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)能抑制M4和M5型AML致癌基因的表達[10]。利巴韋林又名病毒唑、三氮唑核苷，是廣譜強效的抗病毒藥物，目前廣泛應(yīng)用于病毒性疾病的防治，是一種安全的臨床藥物。是以本實驗以人喉癌細胞系 Hep-2 為對象，研究利巴韋林對其放療敏感性的影響，以初步探究利巴韋林能否作為一種新的放療增敏藥物。本實驗中A組各孔未經(jīng)放射治療，雖有不同濃度的利巴韋林作用，但檢測凋亡并無明顯差異，說明利巴韋林單純作用并不能明顯誘導(dǎo)細胞凋亡。B組中利巴韋林0mg/L的孔，可作為單純放療看待。B組中其他各孔與其相比，凋亡率隨著利巴韋林濃度的提高而上升。說明利巴韋林確實能夠起到對hep-2細胞的放療增敏作用，并且隨著劑量的提高作用更明顯。表明利巴韋林有可能在不增加放射劑量的前提下，增加放療效果，減少放射帶來的各種不良反應(yīng)，從而有可能進一步提高喉癌的治愈率，降低轉(zhuǎn)移率，降低放療的不良反應(yīng)。

腫瘤放療的靶向增敏還可以有包括基因治療聯(lián)合放射治療、生物制劑聯(lián)合放射治療以及基于乏氧理論的多維適形放射治療等[11]，已有信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子3反義寡核苷酸基因治療聯(lián)合放療的研究[12]。利巴韋林與其相比，優(yōu)點在于安全和簡便。但其作用的分子機制尚待研究，另外對于其用于放療增敏的最大安全劑量、聯(lián)合放療的最佳配比劑量等，尚需通過動物實驗進一步明確。

參考文獻：

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[9]馬敏杰等.真核細胞翻譯起始因子4E、血管內(nèi)皮生長因子與食管癌血管生成及轉(zhuǎn)移的關(guān)系[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2010,35(11):1634.

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[12]李曉明.Stat3反義寡核苷酸對喉癌Hep-2細胞放療增敏作用的分子機制[J].中國癌癥防治雜志，2010，02(4):261.

收稿日期：(2014-01-26)

文章編號：1007-4287(2015)01-0025-03

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