槲皮素對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞生長(zhǎng)抑制及誘導(dǎo)凋亡作用

槲皮素對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞生長(zhǎng)抑制及誘導(dǎo)凋亡作用

史桂蘭，黃琳，卿海燕，陳琦

(解放軍208醫(yī)院 腫瘤科， 吉林 長(zhǎng)春130062)

肝癌是消化系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，多數(shù)肝癌發(fā)現(xiàn)時(shí)已為晚期，進(jìn)展快，預(yù)后差[1]，從天然植物中尋找高效低毒的抗肝癌藥物的一直是研究熱點(diǎn)[2]。槲皮素(1，3，4，5，7-五羥基黃酮，Quercetin)是存在于多種植物的果實(shí)和花中的天然黃酮類(lèi)物質(zhì)，槲皮素具有抗炎、抗過(guò)敏、抗氧化、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫、降血脂、抗氧化，抗癌等多種生物學(xué)活性，研究表明槲皮素體外可以抑制結(jié)腸癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[3-8]。本研究體外觀察槲皮素對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用，為其進(jìn)一步應(yīng)用于臨床治療肝癌提供理論依據(jù)。

1料和方法

1.1　細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌SMMC-7721細(xì)胞由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室饋贈(zèng)，10%胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)高糖DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，添加青霉素(100 U/ml)和鏈霉素(100 μg/ml)，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2　藥品和試劑

高糖DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Sigma公司)，胎牛血清(杭州四季清公司)， 3-(4，5-二甲基噻唑-2)．2，5．二苯基四氮唑溴鹽(MTT，美國(guó)Sigma公司)，Giemsa染色試劑盒購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司，吖啶橙(AO)染色試劑盒購(gòu)自南京凱基生物公司，AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物公司。槲皮素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，用前溶于二甲基亞砜(DMSO) 配制成1 mol/L溶液，加藥前用含10% DMSO 的雙蒸滅菌水配制成所需的實(shí)驗(yàn)濃度。

1.3　MTT法檢測(cè)槲皮素對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

參考文獻(xiàn)96孔板每孔接種SMMC-7721細(xì)胞1×104個(gè)，[9]MTT法測(cè)定100、80、40、20、10、0 μmol/L槲皮素作用24、 48和72 h對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，并計(jì)算IC50值。

1.4　Giemsa染色觀察細(xì)胞形態(tài)

預(yù)先放置無(wú)菌蓋玻片的6孔板每孔接種5×105個(gè)SMMC-7721細(xì)胞，培養(yǎng)過(guò)夜加入槲皮素，48 h后取出蓋玻片，用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗兩遍，4%對(duì)聚甲醛固定，按照說(shuō)明書(shū)的方法染色，水洗，干燥，鏡檢。

1.5　AO染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡

收集槲皮素作用48 h的SMMC-7721細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/ml，移液器吸取95 μl細(xì)胞懸液于5 ml離心管內(nèi)，加入5 μl AO儲(chǔ)存液混勻，AO終濃度為0.1 mg/ml，吸取10 μl 細(xì)胞懸液滴于顯微載玻片上，蓋玻片封片，避免封入氣泡，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，攝片。

1.6　AnnexinV-FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

參照文獻(xiàn)[10]方法，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作，采用流式細(xì)胞儀測(cè)定槲皮素作用48 h的SMMC-7721細(xì)胞的凋亡率。

1.7　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2結(jié)果

2.1　槲皮素對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

對(duì)照組SMMC-7721細(xì)胞生長(zhǎng)活躍，SMMC-7721細(xì)胞在 10,20，40,60,80,100 μmol/L檞皮素作用24、48和72 h后，生長(zhǎng)均不同程度減慢，抑制率逐漸升高，并呈明顯的濃度和時(shí)間依賴(lài)性(表1)，槲皮素作用SMMC-7721細(xì)胞48 h的IC50為48.8 μmol/L。

2.2　肝癌SMMC-7721細(xì)胞的形態(tài)改變

對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，大小較一致，貼壁生長(zhǎng)；槲皮素IC50組部分SMMC-7721細(xì)胞脫落懸浮于培養(yǎng)液中，貼壁細(xì)胞密度低，形態(tài)不規(guī)則，收縮變圓。

表1　槲皮素對(duì)人SMMC-7721細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用

注：與同時(shí)間0 μmol/L組比較，a：P<0.05，b：P<0.01；c：24 h與72 h組間比較，P<0.05，d：24 h與48 h組間比較，P<0.05.

Giemsa染色可見(jiàn)對(duì)照組細(xì)胞完整，核仁明顯，可見(jiàn)多核細(xì)胞;槲皮素IC50組細(xì)胞皺縮，細(xì)胞核固縮或核碎裂為數(shù)個(gè)小顆粒，表現(xiàn)為典型的凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變,見(jiàn)圖1。

圖1　48.8 μmol/L槲皮素作用48 h SMMC-7721細(xì)胞的Giemsa染色結(jié)果 (×200)

AO染色鏡下觀察，對(duì)照組SMMC-7721細(xì)胞表面為正常細(xì)胞的染色特征，細(xì)胞核呈均染綠色熒光；槲皮素IC50組部分細(xì)胞出現(xiàn)胞質(zhì)濃縮，體積縮小，核固縮，表現(xiàn)為新月?tīng)睢⒛钪闋睿?jiàn)圖2。

圖2　48.8 μmol/L槲皮素作用48 h SMMC-7721細(xì)胞的AO染色結(jié)果 (×200)

2.3　槲皮素誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡

各組SMMC-7721細(xì)胞經(jīng)Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明，槲皮素IC50組早期凋亡率為(49.8± 5.8)%，與陰性對(duì)照組(0.9±0.1)%比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；晚期凋亡率為(14.3±1.8)% ，與陰性對(duì)照組(1.2±0.6)%比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。研究結(jié)果表明槲皮素體外可誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡，見(jiàn)圖3。

圖3　48.8 μmol/L槲皮素作用48 h SMMC-7721細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果

3討論

大量研究表明，腫瘤的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞凋亡有關(guān)[11]，目前臨床應(yīng)用的多種化療藥物主要是通過(guò)誘導(dǎo)其凋亡而發(fā)揮作用的，從天然植物中尋找高效低毒的抗腫瘤藥物是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)之一。本研究首先采用MTT 法檢測(cè)了槲皮素對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞的增殖抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)槲皮素體外明顯抑制肝癌SMMC-7721細(xì)胞的生長(zhǎng)，槲皮素對(duì)其增殖抑制作用隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)和濃度的增加而增強(qiáng)，具有明顯時(shí)間和劑量。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的一種死亡方式，細(xì)胞凋亡與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[12,13]，通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡治療癌癥具有重要意義，許多抗癌藥物通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗癌作用[14]。槲皮素體外是否誘導(dǎo)對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡？本研究采用Giemsa染色、AO 熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)Annexin-V 和PI 雙標(biāo)染色，多種技術(shù)檢測(cè)肝癌SMM-7721 細(xì)胞凋亡情況。

凋亡細(xì)胞具有典型的形態(tài)學(xué)特征，這些特征可以作為鑒定細(xì)胞是否凋亡的標(biāo)準(zhǔn)。凋亡細(xì)胞的典型形態(tài)特征為：細(xì)胞皺縮變圓、體積變小、胞質(zhì)濃縮，染色質(zhì)濃縮，核碎裂，形成凋亡小體等[15]。本研究發(fā)現(xiàn)槲皮素作用SMMC-7721細(xì)胞48 h后，胞膜皺縮、收縮變圓，Giemsa染色可見(jiàn)細(xì)胞核固縮，甚或核碎裂為數(shù)個(gè)小顆粒，表現(xiàn)為凋亡的形態(tài)學(xué)特征。AO熒光染色結(jié)果同Giemsa 染色結(jié)果一致，對(duì)照組細(xì)胞核為均勻綠色熒光，槲皮素組細(xì)胞出現(xiàn)胞質(zhì)濃縮，熒光增強(qiáng)，表現(xiàn)為致密濃縮的綠色熒光，細(xì)胞核固縮，呈新月?tīng)罨蚰钪闋睿芯拷Y(jié)果從形態(tài)學(xué)上初步證實(shí)了槲皮素可誘導(dǎo)SMMC-7721 細(xì)胞凋亡。

同時(shí)本研究采用Annexin V-FITC/PI 雙熒光染色流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)凋亡率，結(jié)果顯示，隨著槲皮素濃度的增加，SMMC-7721細(xì)胞早期和晚期凋亡率與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明槲皮素可能通過(guò)誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡抑制其生長(zhǎng)。另外晚期凋亡率增加表明壞死也可能參槲皮素對(duì)SMMC-7721細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用,其具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，本研究觀察了槲皮素體外對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的增殖抑制作用，并從形態(tài)學(xué)方面觀察到槲皮素可以誘導(dǎo)肝癌SMMC-7721出現(xiàn)典型的凋亡特征，流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)凋亡率結(jié)果與形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果一致，確證槲皮素對(duì)肝癌SMM-7721細(xì)胞的增殖抑制作用是通過(guò)誘導(dǎo)其凋亡實(shí)現(xiàn)的。

[1]Parkin DM,Bray F,Ferlay J,et al.Global cancer statistics,2002[J].CA Cancer J Clin,2005,55:74.

[2]Asia-Pacific Working Party on Prevention of Hepatocellular Carcinoma.Prevention of hepatocellular carcinoma in the Asia-Pacific region:consensus statements[J].J Gastroenterol Hepatol,2010,25:657.

[3]Cnox EJ，Bae SC，Yu R，et al．Dietary vitamin E and quercetin modulate inflammatory responses of collagen-induced arthritis in mice[J].J Med Food，2009，12(4):770.

[4]Cook NC，Samman S.Flavonoids-hemistry,metabolism，cardioprotective effects,and dietary sources[J].Nutr Biochem,2005,7(3):66.

[5]Woo K，Myung H，Eul S，et al.Quercetin decreases the expression of ErbB2 and ErbB3 proteins in HT-29 human colon cancer cells[J].J Nutr Biochem,2005,16(6) :155.

[6]Yang J,Wang L,Chen Z,et al.Antioxidant intervention of smoking-induced lung tumor in mice by vitamin E and quercetin[J].Bio Med Central Cancer,2008,8(4):383.

[7]Chen J,Kim J,Park JK,et al.The antioxidant,rather than prooxidant,activities of queretin on normal cells:quercetin protects mouse thmocytes from glucose oxidase-mediated apoptosis[J].Exp Cell Res,2003,291(10):386.

[8]葉麗紅，趙冬耕，俞晶華，等．抗癌扶正方對(duì)HAC移植性肝癌的抑制作用及形態(tài)影響[J]．中醫(yī)藥信息,2010,27(1):52.

[9]黃河寧,李安章,翁露娜,等.茶多酚錳合成、表征及絡(luò)合和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的研究[J].高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào)，2007，28(6):1072.

[10]Tang XD,Zhou KY,Hou G,et al.Mitochondrial mechanism of apoptosis induced by resveratrol in nasoparyngeal carcinoma cells CNE-2Z[J].Chin J Pharmacol Toxicol,2004,18:171.

[11]Zwick E,Bange J,ULLrich A,et al.Receptor tyrosine kinase as targets for anticancerdrugs[J].Trends Mol Med,2002,8(1):17.

[12]Mrozek A，Petrowsky H,Sturm I,el a1．Conbined p53/Bax mutation results in extremely poor prognosis in gastric carcinoma with low microsatellite instability[J].Cell Death Differ，2003，10(4):461.

[13]金偉,馬力.染料木黃酮對(duì)順鉑誘導(dǎo)肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡的增敏作用[J]．第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，26(8)：761.

[14]Abrahamsen J F,Bakken AM,Bruserud O,et al Flow cytometri measurement of apoptosis and necrosis in cryopreserved PBPC concentrates from patientswith malignant diseases[J].Bone Marrow Transplant,2002,29(2):165.

[15]劉伍梅,汪銘書(shū),程安春.細(xì)胞凋亡檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展[J].中國(guó)獸醫(yī)科技,2004,34(11):45.

收稿日期：(2014-01-22)

文章編號(hào)：1007-4287(2015)01-0017-03