粘質沙雷菌整合子檢測及其與耐藥表型的相關性分析

蘇維奇，朱元祺,李　莉，畢春霞，閆志勇，鄧乃梅

(1.青島市市立醫院 a.檢驗科；b.醫院感染管理科，山東 青島266011；

2.青島大學附屬醫院 檢驗科；3.青島大學醫學院 微生物教研室)

粘質沙雷菌整合子檢測及其與耐藥表型的相關性分析

蘇維奇1a，朱元祺2,李莉1a，畢春霞1a，閆志勇3，鄧乃梅1b*

(1.青島市市立醫院 a.檢驗科；b.醫院感染管理科，山東 青島266011；

2.青島大學附屬醫院 檢驗科；3.青島大學醫學院 微生物教研室)

(ChinJLabDiagn,2015,19:0014)

粘質沙雷菌是一種重要的條件致病菌，廣泛存在于醫院的環境中，在機體抵抗力低下時，可引起呼吸道感染、傷口感染、泌尿道感染以及敗血癥等多種疾病，并可引起醫院內感染的爆發流行[1]。近年來，粘質沙雷菌的檢出率逐年增高，并且其耐藥現象也日趨嚴重，該菌的耐藥機制復雜多樣，包括產生抗菌藥物滅活酶、藥物作用的靶位改變以及外膜通透性障礙等，其耐藥基因可借助質粒、轉座子、整合子等多種耐藥基因移動遺傳因子，在菌種間傳播和傳遞。為了解本地區粘質沙雷菌臨床分離株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類整合子的攜帶情況及其與耐藥表型的相關性，我們對臨床分離的287株粘質沙雷菌進行Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類整合子檢測，探討整合子與耐藥表型的相關性。

1材料與方法

1.1菌株來源實驗菌株來源于青島大學附屬醫院和青島市市立醫院的臨床分離株，共計287株，所有菌株均經VITEK-2 Compact細菌分析系統進行鑒定，所用菌株鑒定板型為GNI卡，藥敏板型為GNS卡，質控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922、銅綠假單胞菌ATCC 27853。

1.2細菌DNA提取采用煮沸法，取細菌培養液2 ml,11 500 g離心1 min，盡量吸凈上清，向沉淀物中加入200 μl緩沖液GA，震蕩至菌體徹底懸浮，向管中加入20 μl蛋白酶K溶液，混勻，加入220 μl緩沖液GB，震蕩15 sec，70℃放置10 min，溶液應變清亮，離心以去除管蓋內壁的水珠，加入220 μl無水乙醇，充分震蕩混勻15 sec，此時可能會出現絮狀沉淀，離心以去除管蓋內壁的水珠，然后移入吸附柱CB3中放到收集管里，13 400 g離心30 s,棄去廢液再加入500 μl緩沖液GD，13 400 g離心30 s,棄去廢液，加入600 μl漂洗液PW，13 400 g離心30 s,棄去廢液，加入50-200 μl洗脫緩沖液TE，室溫放置30 min，將溶液收集至離心管中備用。

1.3PCR引物的設計與合成參照文獻[2]設計Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類整合子整合酶編碼基因的特異性引物，引物序列及產物大小見表1。

表1　Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類整合子基因的特異性引物，引物序列及產物大小

1.4PCR反應及條件優化按照配制的PCR反應混合物，PCR反應體系,RNase Free H2O 17.37 μl,10×PCR Buffer2.5 μl,上游引物(10 μM)1.0 μl,下游引物(10 μM)1.0 μl,TaKaBa Taq(5 U/μl)0.13 μl,模板DNA 1.0 μl,總體積25.0 μl。經反復試驗優化，確定PCR反應條件為預變性94℃ 5 min，變性94℃，30 s，退火46℃，30 s，延伸72℃，30 s，共30個循環，延伸72℃ 10 min。

1.5擴增產物的檢測取5 μl PCR產物，在含0.5 μg/ml溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠中進行電泳，凝膠成像系統觀察電泳結果。

1.6藥敏試驗采用VITEK-2 Compact全自動細菌鑒定和藥敏分析儀配套的革蘭陰性桿菌藥敏卡GNS進行藥敏試驗，抗菌藥物包括氨芐西林、氨曲南、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢吡肟、頭孢噻肟、、亞胺培南、美羅培南、阿米卡星、慶大霉素、環丙沙星、左氧氟沙星和哌拉西林，頭孢哌酮/舒巴坦采用K-B法，藥敏結果按照美國臨床實驗室標準化研究所(CLSI)2011年標準進行判讀。

1.7統計學分析應用SPSS13.0軟件分析Ⅰ類整合子陽性菌株和陰性菌株的耐藥差異，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1整合子檢測結果在287株粘質沙雷菌中，有262株細菌檢出Ⅰ類整合子，檢出率為91.3%，3株細菌檢出Ⅲ類整合子，未檢出Ⅱ類整合子。部分粘質沙雷菌Ⅰ類整合子PCR擴增電泳結果見圖1。

M：100 bp ladder marker(100,200,300,400,500,600,700,800,900,1 000 bp)；1-13：臨床標本；N：陰性對照；P：陽性對照

圖1粘質沙雷菌Ⅰ類整合子(intI)PCR擴增電泳圖

2.2Ⅰ類整合子陽性與陰性菌株藥敏結果比較Ⅰ類整合子陽性菌株對環丙沙星和頭孢噻肟的耐藥率高于Ⅰ類整合子陰性菌株(P均<0.05)，對其他抗菌藥物的耐藥性，Ⅰ類整合子陽性菌株和陰性菌株間差異無統計學意義(P均>0.05),見表2。

表2　Ⅰ類整合子陽性菌株與陰性菌株的藥敏結果

3討論

整合子是存在于細菌質粒和(或)染色體上的一種遺傳結構，它具有捕獲、重排和表達耐藥基因的能力，是細菌多重耐藥迅速發展的重要原因[3]。整合子在整合酶的催化下，能通過位點專一重組系統整合外來的耐藥基因，使耐藥基因不斷的積累，從而使細菌具有耐藥性和多重耐藥性，并通過整合機制使得耐藥基因快速傳播和擴散[4]。

整合子在參入細菌耐藥性的傳播和擴散方面，受整合子整合酶、整合子基因盒以及Ⅰ型整合子樣結構和插入序列共同區(ISCR1)等物質的作用和影響。有文獻報道，ISCR1的廣泛存在可能會造成多種耐藥基因的流行和跨種屬傳播[5]。然而孫靜靜等在對59株泛耐藥鮑曼不動桿菌整合子Ⅰ和ISCR1結構及基因型研究中發現，ISCR1的攜帶率較低，Ⅰ類整合子的檢出率高達86%，而ISCR1的檢出率只有5.3%[6]，由此可見，整合子與ISCR1之間的相互關系是否在不同細菌的種屬間存在差異還有待進一步研究。

本項目研究結果發現，在287株粘質沙雷菌中，有262株細菌檢出Ⅰ類整合子，檢出率為91.3%，3株細菌檢出Ⅲ類整合子，未檢出Ⅱ類整合子，Ⅰ類整合子的檢出率高于陰溝腸桿菌(77.9%)和肺炎克雷伯菌(57.91%)等腸桿菌科細菌[7,8]，說明Ⅰ類整合子在粘質沙雷菌中普遍存在。Ⅰ類整合子陽性菌株對環丙沙星和頭孢噻肟的耐藥率明顯高于Ⅰ類整合子陰性菌株，差異有統計學意義，可能與菌株攜帶qnr基因和blaCTX-M基因有關。Ⅰ類整合子陽性菌株和陰性菌株對青霉素類和大多數頭孢類藥物的耐藥表型差異無統計學意義，其機制有待進一步研究。

綜上所述，本研究通過對287株粘質沙雷菌整合子的攜帶情況與其耐藥表型比較分析，結果發現粘質沙雷菌Ⅰ類整合子的攜帶率較高，并且在粘質沙雷菌中整合子與其耐藥表型特別是與多重耐藥性無明顯的相關性。

參考文獻：

[1]Ktari S,Mahjoubi F,Mnif B,et al.Investigation of three nosocomial outbreaks of Serratia marcescens in an intensive care unit in Sfax-Tunisia[J].Tunis Med,2010,88(7):501.

[2]Goldstein C,Lee MD,Sanchez S,et al.Incidence of class 1 and 2 integrases in clinical and commensal bacteria from livestock,companion animals,and exotics[J].Antimicrob Agents Chemother,2001，45:723.

[3]Rech GD,Hall RM.Gene Cassettes A new class of mobile element[J].Microbiology,1995,141(12):3015.

[4]李彥媚，趙喜紅，徐澤智，等.新型細菌耐藥元件—整合子系[J].中國抗生素雜志，2012,31(1)：1.

[5]陳霞，袁敏，李桂喜，等.基因捕獲元件int1和ISCR1在臨床菌株中的分布及與細菌耐藥性的關系研究[J].中國人畜共患病學報，2013,29(7)：646.

[6]孫靜靜，吳奎海，陳清，等.泛耐藥鮑曼不動桿菌整合子Ⅰ和ISCR1結構及基因分型研究[J].熱帶醫學雜志，2012,12(4)：390.

[7]李巖，蘇建榮，徐淑珍，等.陰溝腸桿菌的Ⅰ類整合子檢測及相關耐藥基因分析[J].中國實驗診斷學雜志，2010,14(9)：1356.

[8]毛璞，傅威，邱桂霞，等.肺炎克雷伯菌Ⅰ類整合子的檢測與鑒定[J].中國抗生素雜志，2013,38(3)：235.

摘要：目的了解本地區粘質沙雷菌臨床分離株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類整合子的攜帶情況，探討整合子與其耐藥表型的相關性。方法收集臨床分離的經VITEK-2 Compact細菌分析系統鑒定的粘質沙雷菌287株，以煮沸法制備細菌DNA作為PCR擴增模板，采用聚合酶鏈反應(PCR)檢測菌株的第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類整合子，分析比較整合子陽性菌株與陰性菌株的藥敏試驗結果差異。結果在287株粘質沙雷菌中，有262株細菌檢出Ⅰ類整合子，檢出率為91.3%，3株細菌檢出Ⅲ類整合子，未檢出Ⅱ類整合子。藥敏結果顯示，第Ⅰ類整合子陽性菌株對環丙沙星和頭孢噻肟的耐藥率高于Ⅰ類整合子陰性菌株(P均<0.05)，對其他抗菌藥物的耐藥性，Ⅰ類整合子陽性菌株和陰性菌株間差異無統計學意義(P均>0.05)。結論Ⅰ類整合子在粘質沙雷菌中普遍存在，Ⅰ類整合子與粘質沙雷菌的多重耐藥無明顯的相關性。

關鍵詞：粘質沙雷菌；耐藥性；整合子

Serratia marcescens integron test and Associated analysis with drug resistance phenotypeSUWei-qi,ZHUYuan-qi,LILi,etal.(Departmentoflaboratory,QingdaoMunicipalHospital,Qingdao266011,China)

Abstract:ObjectiveUnderstanding of the carrying situation in the region of Serratia marcescens isolates Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ integron,To explore the relationship between integrons and drug resistance phenotype.MethodsClinical isolates collected by VITEK-2 Compact analysis system for identification of 287 strains of Serratia marcescens.Prepared to boil PCR amplification of bacterial DNA as a template,using the polymerase chain reaction (PCR) testing of classⅠ,Ⅱ,Ⅲ integron.Analysis and comparison the differences of integron positive strains and negative strains in drug sensitive test.ResultsIn 287 strains of Serratia marcescens,262 strains of bacteria detected integron,the detection rate was 91.3%,3 strains of bacteria detected class Ⅲ integron,II integron were not detected.The drug sensitivity results showed,the classⅠ integron positive strains resistant to ciprofloxacin and cefotaxime were higher than that of Ⅰintegron negative strains (P<0.05).Resistance to other antimicrobial drugs,among Ⅰ integron positive and negative strains were no significant differences (P>0.05).ConclusionⅠ integron prevalent in Serratia marcescens,class Ⅰ integron and multidrug-resistant Serratia marcescens is no significant correlation.

Key words:Serratia marcescens;Drug resistance;Integron

收稿日期：(2014-05-10)

文獻標識碼：A

中圖分類號：R446.5

文章編號：1007-4287(2015)01-0014-03

通訊作者*

基金項目：青島市公共領域科技支撐計劃項目[2012-1-3-1-(18)-nsh]