甲狀腺癌患者血漿miR-221的表達及臨床意義

甲狀腺癌患者血漿miR-221的表達及臨床意義

徐升強

(武漢市第一醫院 檢驗科,湖北 武漢430022)

本研究擬定量檢測乳頭狀甲狀腺癌患者外周血中miR-221水平，分析其作為乳頭狀甲狀腺癌生物標志物的可行性。

1材料和方法

1.1標本采集

實驗共收集本院住院部53例乳頭狀甲狀腺癌患者，33例甲狀腺良性結節患者，另外50例排除各種腫瘤的健康志愿者用于對照。所有納入研究的個體都簽署了知情同意書，經本院倫理委員會批準。乳頭狀甲狀腺癌和甲狀腺良性結節均經由病理切片診斷。乳頭狀甲狀腺癌患者男5例，女48例，平均年齡38.6±6.9歲。甲狀腺良性結節患者男6例、女27例，平均年齡40.2±7.3歲。健康對照組男15例，女35例，平均年齡37.4±8.2歲。清晨采集患者外周血2 ml，EDTA抗凝，3 000 g離心5 min，上清微量離心管再次12 000 g離心10 min，上清保存于-80℃備用。所有標本采集后4 h內處理完畢。

1.2MiRNA提取

采用miRcute miRNA提取試劑盒(天根生物技術公司，北京)按照說明書進行抽提血漿miRNA。400 μl血漿與等量的變性液混勻后加入5 μl合成的cel-miR-39(5fmol/μl)。Cel-miR-39被用于操作過程中的內參。最后用30 μl無RNA酶的水溶解miRNA。

1.3逆轉錄

用miRcute miRNA 單鏈cDNA合成試劑盒(天根生物技術公司，北京)合成miRNA的cDNA。加A反應在20 μl體系中進行：11.6 μl無RNA酶ddH2O，2 μl 10×逆轉錄緩沖液，0.4 μl Poly(A)聚合酶(5 U/μl)，4 μl 5×rATP溶液，2 μl miRNA。混勻后37℃反應60 min。取2 μl反應物用于逆轉錄，其余保存于-80℃。逆轉錄同樣在20 μl體系中進行：11.5 μl 無RNA酶的ddH2O，1 μl RNasin(40 U/μl)，2 μl 10×RT緩沖液，2 μl 10×RT引物，1 μl dNTP混合物(每種2.5 mM)，0.5 μl Quant RTase，2 μl Poly(A)反應產物。混勻后37℃反應60 min。合成的cDNA保存于-80℃備用。

1.4定量RT-PCR分析

在20 μl體系中進行qRT-PCR反應：7.2 μl ddH2O，10 μl 2×miRcute miRNA 預混液(含SYBR和ROX)，0.4 μl逆轉錄引物(10 μM)，0.4 μl前向引物(10 μM)，2 μl cDNA。混合物被均分為兩份。反應條件為：94℃ 2 min預變性后，40個循環于94℃ 2 s，60攝氏度34 s。反應在ABI step-one儀器上進行，儀器自動設定循環閾值(Ct)。miR-221的特異引物： GGGAGCTACATTGTCTGCTGGTTTC； U6b特異引物：ACGCAAATTCGTGAAGCGTT，cel-miR-39特異引物:CACCGGGTGTAAATCAGCTTG。B6b和cel-miR-39被用作內參。根據Tomasetti’s的描述，ΔCTmiR-221=CTmiR-221-CTU6b-CTcel-miR39，ΔCTmiR-221越高miR-221水平越低。SLE患者較正常對照miR-221的相對表達水平以2-ΔΔCT表示。每個定量反應設置復孔，結果取均值。

1.5統計學分析

miR-221的表達方式為均值±SD。通過Wilcoxon秩和檢驗對兩組間均值進行比較。受試者工作曲線(ROC)分析診斷效率。P<0.05被認為有統計學意義。所有的統計分析采用SPSS13.0軟件進行。

2結果

2.1miR-221在各研究組中的水平

乳頭狀甲狀腺癌患者組miR-221水平顯著高于正常對照組[-31.31±3.10 (95%CI:-30.28--32.34,P=0.035) versus -29.33±3.23(95%CI:-28.55—30.67),P=0.038]。乳頭狀甲狀腺癌患者組miR-221平均水平約為正常對照組的3.71倍。乳頭狀甲狀腺癌患者miR-221水平與甲狀腺良性結節，甲狀腺良性結節與正常對照的比較情況見圖1。

2.2miR-221在甲狀腺手術前后的水平

比較乳頭狀甲狀腺癌手術前及術后一周血漿中miR-221水平發現，術后患者血漿miR-221水平顯著下降[術前-31.31±3.10 (95%CI:-30.28--32.34,P=0.035) vs 術后-33.33±3.86(95%CI:-31.43—35.32),P=0.022]，手術后一周血漿miR-221水平下降約4.06倍(圖2)。

2.3miR-221對乳頭狀甲狀腺癌的診斷評價

ROC曲線下面積為0.75±0.06 (95%CI:0.63-0.88,P=0.01)(圖3)。當miR-221檢測以ΔCT=-30.27為臨界值時，其敏感度為75.9%，特異度為62.1%。陽性預測值66.7%，陰性預測值72.0%。

圖1血漿miR-221在各研究組間的水平。 圖2乳頭狀甲狀腺癌手術前后血圖3血漿miR-221對乳頭狀甲狀腺癌

乳頭狀甲狀腺癌患者血漿miR-221漿miR-221水平。乳頭狀甲診斷作用的ROC分析

水平顯著高于甲狀腺良性結節及健狀腺癌患者血漿miR-221水

康對照(P<0.05)，甲狀腺良性結節平手術后顯著下降(P<0.05)

患者與健康對照血漿miR-221水平

無顯著差異(P>0.05)

3討論

本研究中，我們通過實時定量逆轉錄PCR技術檢測乳頭狀甲狀腺癌患者血漿循環miR-221的水平。我們發現與甲狀腺良性結節及健康對照者相比，乳頭狀甲狀腺癌患者血漿miR-221水平顯著增高(P<0.01)，手術后此miRNA水平顯著下降(P<0.01)。乳頭狀甲狀腺癌術后、甲狀腺良性結節及健康對照者血漿miR-221水平無顯著性差異(P>0.05)。

人miR-221定位于X染色體，其序列在各物種間高度保守。已有的研究發現miR-221在不同的腫瘤發病中具有不同的作用，在一些腫瘤中起抑制作用而在另一些腫瘤中則可能起刺激作用。細胞周期調劑蛋白p27 Kip1的編碼基因被認為是miR-221的一個靶點，在胰腺癌、胃癌、甲狀腺癌、乳腺癌、肝癌及肺癌細胞中， miR-221與p27 Kip1的表達呈負相關[5-7]，說明miR-221參與細胞周期的調節。miR-221在腫瘤細胞中可以同時調節多種腫瘤相關基因的表達從而達到對腫瘤發生協同刺激作用[8]。

自從發現循環miRNA在外周血中可以穩定存在，miRNA已被作為生物標志物進行廣泛的研究。miRNA作為生物標志物具有多種優點[9]：①比mRNA穩定。miRNA在血漿中能夠被較長時間的保存，并且對反復凍融等苛刻條件不敏感。②利于檢測。當前對miRNA的實時定量檢測技術已經比較成熟。較之對蛋白等生物標志物的檢測，能夠通過實時定量PCR檢測的生物標志物具有更高的診斷敏感度和特異度。③miRNA在體內的功能十分豐富，對其進行高通量的定量分析，有利于及早全面了解機體健康狀況。多項研究已經證實乳頭狀甲狀腺癌組織中高表達miR-221。至今尚未見到miR-221作為乳頭狀甲狀腺癌患者血漿生物標志物。本研究中，我們檢測了乳頭狀甲狀腺癌患者血漿循環miR-221水平，發現miR-221在乳頭狀甲狀腺癌患者血漿中高表達(P<0.01)。血漿miR-221對乳頭狀甲狀腺癌具有中等強度的診斷效能(AUC=0.75±0.06)。

總之，本研究檢測了乳頭狀甲狀腺癌患者手術前后、甲狀腺良性結節及健康人血漿miR-221水平，分析其作為乳頭狀甲狀腺癌生物標志物的特性。我們的數據提示miR-221在乳頭狀甲狀腺癌患者血漿中高表達。對乳頭狀甲狀腺癌具有中等強度的診斷效能，進一步可聯合其他乳頭狀甲狀腺癌的生物標志物來提高血漿miR-221對乳頭狀甲狀腺癌的診斷效能。

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收稿日期：(2013-11-12)

文章編號：1007-4287(2015)03-0421-03