硒對病毒性心肌炎小鼠心肌的保護(hù)作用及其機制研究

硒對病毒性心肌炎小鼠心肌的保護(hù)作用及其機制研究

黎萍，鄭百紅*，潘薇，徐文靜，許忠

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院 兒科， 吉林 長春130041)

病毒性心肌炎(VMC)是小兒心血管系統(tǒng)中最常見疾病。VMC臨床表現(xiàn)輕重不一，部分急性VMC可導(dǎo)致心力衰竭或者嚴(yán)重的心律失常，嚴(yán)重威脅著兒童的身體健康[1]。胰島素樣生長因子-1(IGF-1)能動員心肌組織中的多能心肌干細(xì)胞，并促進(jìn)其增殖、分化，可補充病理狀態(tài)下死亡的心肌細(xì)胞[2]。我們前期臨床研究表明，硒可通過清除氧自由基，通過抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)保護(hù)病毒性心肌炎小兒的心肌[3]。而硒是否能影響病毒性心肌炎小鼠心肌組織中IGF-1表達(dá)目前鮮有報道，本研究將以維生素C干預(yù)為對照，闡明硒干預(yù)對病毒性心肌炎小鼠的心肌保護(hù)作用以及對IGF-1表達(dá)的影響。

1材料與方法

1.1病毒及主要試劑

柯薩奇B3病毒(CVB3)的Nancy株由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物教研室惠贈。本研究中所使用的CVB3半數(shù)組織感染量為100 TCID50/0.1 ml，-80℃保存?zhèn)溆谩單徕c片為北京曙光藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，維生素 C為東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥有限公司生產(chǎn)。小鼠IGF-1的ELISA試劑盒購自武漢博士德生物工程公司；兔抗小鼠IGF-1多克隆一抗為Bioworld 公司產(chǎn)品，組織裂解液和蛋白濃度測定試劑盒、HRP 標(biāo)記的二抗均為上海碧云天公司產(chǎn)品。

1.2實驗動物及分組

80只4周齡BALB/c雄性小鼠，隨機分為4組：①正常對照(n=20)：連續(xù)3天腹腔注射不含病毒的培養(yǎng)液200 μl；②病毒對照組(n=20)：腹腔注射100 TCID50CVB3病毒液200 μl；連續(xù)3天；③維生素C對照組(n=20)：自接種病毒液當(dāng)日(記為第0天)開始，給予200 mg·kg-1d-1的維生素C灌胃；④硒干預(yù)組(n=20)：亞硒酸鈉， 劑量為 100 μg/kg ，每日1次。各組連續(xù)處理14天，并于第15天分別眼球后取血后斷頸處死，同時取心臟，沿心縱軸眼科剪切開心臟，一半10%甲醛固定，待蘇木素-伊紅染色后行病理學(xué)檢查，另外二分之一置于-80℃冰箱凍存。

1.3病理學(xué)檢查

常規(guī)制作病理切片，經(jīng)過蘇木素-伊紅染色后，在光鏡下，每張切片隨機取5個視野，心肌病變面積的計算公式為每個高倍視野中炎性細(xì)胞浸潤及壞死區(qū)域面積占整個視野面積的百分比，并依此判斷心肌病理變化程度。無病變0分；病變面積小于25%記為1分，25%-50%記為2分，50%-75%記為3分；大于75%記為4分；最后計算心肌病變積分。

1.4ELISA法檢測小鼠血清IGF-1水平

本研究采用美國Bio-tek，Instruments有限公司生產(chǎn)的ELX-800酶標(biāo)儀、卡爾文生物科技有限公司生產(chǎn)的試劑盒檢測小鼠血清IGF-1，比較各組間的IGF-1水平差異。

1.5Western blot 檢測

采用組織裂解液裂解心肌組織，蛋白定量后，取30 μg總蛋白上樣，電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，封閉后，用封閉液1∶400稀釋相應(yīng)一抗后浸泡膜，洗膜，用封閉液1∶5000稀釋相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗后浸泡膜，ECL顯影，以GIS數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)分析蛋白雜交帶光密度，IGF-1/β-actin代表IGF-1的相對表達(dá)量。

1.6數(shù)據(jù)分析

2結(jié)果

2．1小鼠生存率比較

實驗無意外死亡。正常組小鼠狀態(tài)良好，無死亡；病毒對照組小鼠第3天出現(xiàn)毛蜷縮，進(jìn)食減少，激惹，體重增加緩慢，第6、7天分別死亡1只，第8天、第9天分別死亡1只，第12天、第13天分別死亡2只，14天生存率60.0%(12/20)。維生素C以及硒干預(yù)組小鼠14d生存率分別為80.0%(16/20)、 85.0%(17/20)。與病毒對照組比較，維生素C以及硒干預(yù)組生存率明顯提高，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，維生素C對照組和硒干預(yù)組之間生存率無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

2.2心肌組織病理學(xué)改變

維生素C、硒干預(yù)組及病毒對照組小鼠心肌組織可見炎性細(xì)胞浸潤，心肌纖維斷裂和局灶性壞死，其中病毒對照組可見炎性細(xì)胞浸潤呈片狀及彌漫性，心肌纖維斷裂和局灶性壞死，維生素C、硒干預(yù)組病變較病毒對照組輕，炎性細(xì)胞浸潤少，壞死灶小且減少，如表1所示，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而后兩組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。正常對照組小鼠心肌組織未見明顯病變。

表1　各組小鼠心肌病理積分及心臟重/體重比變化

注：*與病毒對照組及正常對照組比，P<0.01；△與正常對照組比，P<0.01；*之間比較：P>0.05。

2.3小鼠血清IGF-1水平檢測

不同組別之間IGF-1水平詳細(xì)數(shù)據(jù)見表2，可見病毒對照組小鼠的IGF-1水平顯著低于正常對照組；維生素C對照組與硒干預(yù)組IGF-1水平顯著高于病毒對照組，見表2。

表2　各組小鼠血清IGF-1水平

注：*與病毒對照組及正常對照組比，P<0.01；△與正常對照組比，P<0.01；*之間比較：P>0.05。

2.4Western blot法檢測各組心肌IGF-1表達(dá)

圖1為各組小鼠心肌組織的IGF-1蛋白電泳圖，表3為IGF-1相對表達(dá)量及分析。與正常對照組相比，其他3組IGF-1表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；維生素C、硒干預(yù)組間IGF-1表達(dá)無顯著差異(P>0.05)；與維生素C、硒干預(yù)組相比，病毒對照組的IGF-1表達(dá)明顯降低，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3討論

CVB3感染所致VMC在兒科臨床較為常見，其發(fā)病機制主要包括：CVB3的直接毒性作用，機體的免疫反應(yīng)以及氧化作用等[4]。嚴(yán)重的急性VMC可導(dǎo)致心力衰竭或嚴(yán)重的心律失常，是小兒猝死的重要原因之一；部分患兒可發(fā)展成為慢性心肌炎，甚至進(jìn)展為擴張型心肌病[5]。VMC也成為兒童后天性心臟病的主要病因，嚴(yán)重威脅著小兒的身體健康。

圖1　各組小鼠心肌IGF-1蛋白電泳圖

組別IGF-1正常對照組0.93±0.02 病毒對照組0.21±0.05△維生素C對照組0.62±0.15*硒干預(yù)組0.56±0.21*F9.34P<0.001

注：*與病毒對照組及正常對照組比，P<0.01；△與正常對照組比，P<0.01；*之間比較：P>0.05。

本研究表明，病毒對照組小鼠的心肌組織具有典型的病毒性心肌炎病理改變，而心肌IGF-1表達(dá)水平較正常對照組顯著降低，提示IGF-1與病毒性心肌炎的發(fā)展有關(guān)。IGF-1高表達(dá)對心血管系統(tǒng)具保護(hù)作用。IGF-1作為一種高效生長因子，可促進(jìn)心肌細(xì)胞DNA合成。研究表明，IGF-1高表達(dá)能通過提高一氧化氮合酶活性，發(fā)揮促進(jìn)自由基清除、擴血管及干細(xì)胞動員等作用，還能通過抗心肌細(xì)胞凋亡作用及激活K+通道開放減少缺血再灌注損傷，發(fā)揮保護(hù)缺血性梗死心肌的作用[6]，另外，低IGF-1水平是心血管疾病一個獨立危險因子，可增加心源性死亡的風(fēng)險[2]。本研究表明，小鼠感染CVB3后，IGF-1表達(dá)下降；給予維生素C或者硒可使心肌細(xì)胞的IGF-1升高，減少心肌受損。

研究表明，硒能促進(jìn)細(xì)胞再生，抗感染，清除自由基，改善心肌功能等多種生物活性[3，7]。本研究中硒干預(yù)組VMC小鼠與維生素C對照組比較，結(jié)果顯示與病毒對照組相比，維生素C、硒干預(yù)組心肌病理改變均明顯減輕，IGF-1表達(dá)均增加，有統(tǒng)計學(xué)差異。本研究維生素C、硒干預(yù)組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義；提示硒對VMC心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，硒通過上調(diào)病毒性心肌炎小鼠的IGF-1表達(dá)，發(fā)揮了對病毒感染所致心肌損傷的保護(hù)作用。IGF-1是生長激素釋放激素-生長激素-IGF-1軸的主要效應(yīng)分子，硒是否通過該軸發(fā)揮心肌保護(hù)作用尚待進(jìn)一步研究證實。

綜上，硒可上調(diào)VMC小鼠的IGF-1表達(dá)，減輕CVB3病毒感染所導(dǎo)致的心肌損傷，本研究為硒在病毒性心肌炎的臨床應(yīng)用提供了實驗基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

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收稿日期：(2014-01-16)

文章編號：1007-4287(2015)03-0352-03

通訊作者*

基金項目：長春市科技局項目(2012-150-12SF78)