創(chuàng)傷/燒傷后單核-巨噬細胞變化及調(diào)節(jié)措施研究進展

馬曉媛，靳 賀，梁華平

嚴重創(chuàng)傷/燒傷可致機體各器官和組織發(fā)生一系列病理生理改變，其病理機制涉及神經(jīng)－內(nèi)分泌－免疫網(wǎng)絡(luò)以及凝血、纖溶、血管內(nèi)皮細胞系統(tǒng)等。單核－巨噬細胞是介導(dǎo)體內(nèi)炎癥反應(yīng)的主要效應(yīng)細胞之一，在損傷相關(guān)模式識別分子及病原體相關(guān)模式識別分子的刺激下可迅速產(chǎn)生多種炎癥介質(zhì)，啟動全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)、代償性抗炎反應(yīng)綜合征(CARS)或混合拮抗反應(yīng)綜合征(MARS)的級聯(lián)反應(yīng)病理過程，最終導(dǎo)致機體的免疫功能紊亂及多器官功能的損害。深入研究嚴重創(chuàng)傷/燒傷后單核-巨噬細胞的變化規(guī)律，闡明其變化的分子機制，提出相應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)措施則可為臨床創(chuàng)傷/燒傷患者的救治提供新的策略。本文就近年來單核－巨噬細胞在創(chuàng)傷/燒傷領(lǐng)域中的相關(guān)研究進展作一簡要概述。

1 嚴重創(chuàng)傷/燒傷后單核－巨噬細胞數(shù)量及功能的改變

眾所周知，機體遭受創(chuàng)傷/燒傷后，先后有中性粒細胞、單核細胞及淋巴細胞侵潤到傷口(道)或創(chuàng)面部位，清除創(chuàng)傷局部的壞死組織、細胞碎片及污染的病原微生物，并參與創(chuàng)面愈合和組織修復(fù)過程。近年來大量研究證實，創(chuàng)傷/燒傷后可致機體全身的單核－巨噬細胞的數(shù)量和功能發(fā)生改變，進而介導(dǎo)傷后的免疫功能紊亂及多器官的炎性損害進程。

1.1 嚴重創(chuàng)傷/燒傷后單核-巨噬細胞亞群及數(shù)量變化Noel等［1］報道了熱力損傷能增加骨髓、脾臟及外周血中炎性單核細胞的數(shù)量。Howell等［2］在研究中發(fā)現(xiàn)燒傷后粒細胞單核細胞前體細胞(GMPs)中升高的巨噬細胞活化因子家族轉(zhuǎn)錄活化因子B(MafB)可通過下調(diào)紅系特異核蛋白轉(zhuǎn)錄因子(GATA-1)及上調(diào)巨噬細胞集落刺激因子受體(M-CSFRs)的表達量，進而抑制單核細胞分化為樹突狀細胞，但可促進其分化為巨噬細胞。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，嚴重創(chuàng)傷患者單核細胞白細胞分化抗原(CD14highCD16+)亞群明顯擴增，該亞群單核細胞可產(chǎn)生抗炎細胞因子，與創(chuàng)傷后的免疫抑制狀態(tài)相關(guān)［3］。

1.2 嚴重創(chuàng)傷/燒傷后單核-巨噬細胞功能變化 嚴重創(chuàng)傷/燒傷不僅可致單核－巨噬細胞的吞噬、殺菌功能降低，抗原遞呈功能減弱，還可改變其活化狀態(tài)、表面抗原的表達、分泌功能及相關(guān)蛋白酶水平。Lopez等［4］發(fā)現(xiàn)，從燒傷小鼠體內(nèi)分離出的腹腔巨噬細胞對脂多糖(LPS)的刺激呈現(xiàn)高應(yīng)答狀態(tài)，提示燒傷可誘導(dǎo)巨噬細胞的活化。Oh等［5］在氫氧化鈉(NaOH)制備燒傷小鼠眼模型中發(fā)現(xiàn)巨噬細胞遷移抑制因子(MIF)在眼表面表達量高于正常水平，而MIF可刺激巨噬細胞的活化，通過促進環(huán)氧酶(Cox-2)，抑制p53通路以阻止巨噬細胞因失活而導(dǎo)致的凋亡，從而維持機體的炎性反應(yīng)。然而在創(chuàng)傷后期特別是創(chuàng)傷后膿毒癥階段單核細胞則發(fā)生失活，且該變化與創(chuàng)傷后膿毒癥患者的高死亡率相關(guān)［6］。

無論是創(chuàng)傷還是燒傷均可致單-巨噬細胞表面人白細胞抗原(HLA-DR)的表達量降低［2］，其下降程度和持續(xù)時間與損傷嚴重程度密切相關(guān)。Yang等［6］進一步發(fā)現(xiàn)，燒傷患者外周血中CD14+單核細胞表面HLA-DR的表達明顯低于正常人，且與其第1、7、28天后分泌的IL-10呈負相關(guān)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)燒傷后24h單核細胞表面CD47表達持續(xù)下降，并且CD47的低表達與燒傷后早期嚴重程度有關(guān)［7］。由于CD47在單核細胞及其分化出的樹突細胞中均扮演了死亡受體的角色，故認為燒傷患者CD47的低表達可增加單核細胞的數(shù)量及單核細胞表面CD14表達量。Toll樣受體是參與機體免疫應(yīng)答的一類重要跨膜分子，研究發(fā)現(xiàn)肺泡巨噬細胞表面Toll樣受體(TLR4)在小鼠胸部鈍性傷48h后表達量顯著增高，TLR4的啟動可以防御機體在創(chuàng)傷后感染某些革蘭陰性菌［8］。

嚴重?zé)崃p傷也可導(dǎo)致巨噬細胞的分泌功能發(fā)生改變，如前列腺素E2(PGE2)生成增加、白細胞介素-12(IL-12)生成減少，進而引起輔助性T細胞(Th2)介導(dǎo)的的抗炎因子IL-4與IL-10的產(chǎn)生增多［9］。已有研究證實嚴重?zé)齻缙诟闻KKupffer細胞(KCs)是機體釋放細胞因子的主要來源之一，如分泌促炎因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-1［10］。Neunaber等［11］在大鼠創(chuàng)傷模型中發(fā)現(xiàn)，股骨骨折經(jīng)髓內(nèi)固定后伴或不伴隨胸部鈍性傷均可促進肺泡巨噬細胞(AM)和肝臟Kupffer細胞分泌IL-6、TNF-α、趨化因子2(CCL2)、CCL3、CCL4、CCL5和CCL7在內(nèi)的細胞因子，進而激活機體免疫應(yīng)答。Qin等［12］在探究醉酒后發(fā)生燒傷的患者機體炎癥反應(yīng)及免疫功能的變化時發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)表達水平下調(diào)，該變化參與介導(dǎo)了燒傷后的免疫功能失衡。West和Mold［13］發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷患者單核細胞內(nèi)血紅素加氧酶1(HO-1)水平增加，但并未發(fā)現(xiàn)其與HLA-DR表達降低及單核細胞的失活相關(guān)。

2 創(chuàng)傷/燒傷后單核-巨噬細胞功能變化的分子機制

2.1 PI3K/Akt信號通路活性受抑，致單核-巨噬細胞黏附力和吞噬能力下降 磷酯酰肌醇3激酶/絲氨酸激酶(PI3K/Akt)信號通路在細胞代謝、細胞周期調(diào)控、細胞凋亡等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用。近期有研究者在電灼傷模型中發(fā)現(xiàn)經(jīng)電灼傷的小鼠血清可誘導(dǎo)單核細胞分泌TNF－α并增強單核細胞與血管內(nèi)皮細胞的黏附能力，通過阻斷PI3K/Akt信號通路可以抑制單核細胞與血管內(nèi)皮細胞的黏附［14］。Hsieh等［15］在創(chuàng)傷失血小鼠模型中發(fā)現(xiàn)肝臟Kupffer細胞噬菌能力降低，但該變化與細胞缺氧及HIF-1的活性升高無關(guān)，而與Akt的活性受抑制有關(guān)［16］。

2.2 MafB(V-maf musculoaponeurotic fibrosacroma oncogene homolog)信號通路活化，上調(diào)巨噬細胞的分化 嚴重?zé)齻∈蠊撬柚卸嗄茉煅杉毎傲＜毎麊魏思毎绑w細胞(GMPs)的數(shù)量顯著增加。燒傷小鼠GMPs的球蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(GATA-1)表達明顯降低，而該因子對樹突狀細胞(DC)的分化是必需的。與此相反，燒傷小鼠GMPs的MafB與M-CSFRs的表達呈現(xiàn)高水平，這二者均與單核細胞的生成有關(guān)。與假傷組相比，來自燒傷組小鼠的GMPs向巨噬細胞分化的數(shù)量升高至1.7倍以上，而向DC分化的數(shù)量降低至1.6倍以下。進一步分析發(fā)現(xiàn)，燒傷后GMPs中升高的MafB可通過下調(diào)GATA-1及上調(diào)M-CSFRs的表達量，進而抑制單核細胞分化為DC，但促進其分化為巨噬細胞［2］。

2.3 Fas/FasL信號通路激活，調(diào)節(jié)促炎和抑炎介質(zhì)的產(chǎn)生Seitz等［17］在大鼠胸部創(chuàng)傷模型中發(fā)現(xiàn)肺泡巨噬細胞表面Fas/FasL系統(tǒng)被激活，由于FasL的激活，導(dǎo)致肺泡巨噬細胞釋放促炎因子。Niesler等［18］學(xué)者也發(fā)現(xiàn)肺泡巨噬細胞(AM)表面FasL與Fas受體結(jié)合后，激活Fas/FasL系統(tǒng)，這不會誘發(fā)AM發(fā)生凋亡，但會改變細胞因子的釋放。在實驗中證實遭受胸部鈍性傷后的大鼠體內(nèi)使用可溶性FasL刺激后，AM中IL-6水平升高，IL-10水平下降，然而單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)表達無明顯改變。這些結(jié)果均提示Fas/FasL系統(tǒng)在胸部創(chuàng)傷后介導(dǎo)機體炎癥應(yīng)答過程中的確表現(xiàn)出重要作用。

2.4 NF-κB信號通路活化，影響細胞因子的分泌 NF-κB在創(chuàng)傷后炎癥反應(yīng)中，通過提高p65/p50磷酸化水平或提高與相應(yīng)DNA位點結(jié)合，從而激活該信號通路以介導(dǎo)炎癥介質(zhì)的生成。Lopez等［4］通過分析燒傷小鼠腹腔巨噬細胞在LPS刺激下的NF-B的p65Ser536磷酸化水平，發(fā)現(xiàn)其水平增高與其對LPS的高應(yīng)答狀態(tài)及過度激活密切相關(guān)。Suzuki等［19］在創(chuàng)傷出血模型中發(fā)現(xiàn)過氧化物酶增殖物激活受體(PPAR)通過提高NF-B與相應(yīng)DNA位點結(jié)合促進了肝臟Kupffer細胞釋放細胞因子。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷失血模型小鼠Kupffer細胞吞噬功能降低的同時，伴有p38 MAPK和NFB活性增加［16］。Chen等［10］將燒傷大鼠肝臟Kupffer細胞進行體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過高遷移率族蛋白1(HMGB1)刺激后，通過TLR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)肝臟Kupffer細胞的NF-B活性增加，進而增強促炎因子TNF-α、IL-1的分泌。

2.5 MCP-1/CCL-2及CCR2信號通路激活，增強單核-巨噬細胞的趨化能力但下調(diào)炎癥反應(yīng) Seitz等［20］觀察到胸部損傷后肺泡灌洗液中趨化因子水平、肺巨噬細胞數(shù)量和單核細胞遷移至肺部的百分比均升高。同時發(fā)現(xiàn)肺挫傷提高了單核細胞、肺間質(zhì)巨噬細胞CCR2的mRNA表達及肺巨噬細胞中單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)的mRNA表達。由此可見，胸部鈍性傷后肺巨噬細胞可通過釋放趨化因子，從而提高潛在的刺激單核細胞遷移的能力，而單核細胞通過上調(diào)這些趨化因子受體的表達，然后遷移至肺組織。Suresh等［21］在肺挫傷小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，肺組織中MCP-1/CC趨化因子配體-2(CCL-2)水平明顯增高，進一步實驗證實，應(yīng)用多克隆抗體中和CCL-2后，損傷肺組織灌洗液中白蛋白、IL-6含量增加且肺組織中髓過氧化物酶活性更高;應(yīng)用CCR2－/－小鼠制備肺損傷模型，其釋放的IL-1、IL6、巨噬細胞炎性蛋白-1(MIP-1)、角質(zhì)細胞趨化因子(相當于人IL-8)及浸潤的中性粒細胞更多，肺泡巨噬細胞雖然減少但以M1表型(促炎表型)為主，說明肺挫傷后升高的CCL-2可通過作用于CCR2下調(diào)炎癥反應(yīng)從而發(fā)揮對肺損傷的保護作用。

2.6 TGF-β、MCSF和C反應(yīng)蛋白(CRP)促進單核細胞亞群分化嚴重創(chuàng)傷患者單核細胞CD14highCD16+亞群明顯擴增，且與創(chuàng)傷血清中高水平的TGF-β、MCSF和CRP密切相關(guān)。通過健康志愿者單核細胞與創(chuàng)傷血清共培養(yǎng)，結(jié)合血清中細胞因子抗體中和實驗，證實創(chuàng)傷血清中高濃度的TGF-β和MCSF是激活并誘導(dǎo)單核細胞分化為高表達CD14和CD16亞群的主要細胞因子。而創(chuàng)傷急性期外周血清中高水平CRP則可作用于單核細胞的CD16(CD16被認為是CRP的受體)，促進CD14highCD16+亞群產(chǎn)生抗炎細胞因子，后者介導(dǎo)了創(chuàng)傷后的免疫抑制狀態(tài)［3］。

3 創(chuàng)傷/燒傷后單核－巨噬細胞功能失衡的逆轉(zhuǎn)措施

3.1 普萘洛爾 腎上腺素能受體阻斷劑－普萘洛爾已被證實可改善嚴重?zé)齻麢C體的高代謝狀態(tài)。Muthu等［22］進一步發(fā)現(xiàn)燒傷小鼠的交感神經(jīng)興奮性增加，進而促進單核細胞的生成以及巨噬細胞釋放細胞因子。其中高表達F4/80+Grl+的小鼠巨噬細胞屬于炎性表型，燒傷后給予普萘洛爾可減少因燒傷誘導(dǎo)的炎性單核細胞的增多，同時增加粒細胞數(shù)量，進而改善了燒傷后粒細胞和炎性單核細胞的炎癥應(yīng)答能力。

3.2 重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(rhGM-CSF)劉繼松等［23］通過臨床對比研究發(fā)現(xiàn)外用rhGM-CSF凝膠劑與單純凝膠劑基質(zhì)相比能夠促進深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面壞死組織的脫落，加快創(chuàng)面愈合。其可能機制為:(1)rhGM-CSF可趨化血液中的中性粒細胞和單核細胞遷移至創(chuàng)面，并活化其功能，表現(xiàn)為增強中性粒細胞、巨噬細胞的氧化代謝，上調(diào)巨噬細胞數(shù)量，增強其吞噬及分泌功能，利于自身清除創(chuàng)面的壞死組織和細胞碎片，使創(chuàng)面壞死組織脫落。(2)rhGMCSF可通過激活的炎性細胞釋放各種蛋白酶，以促進燒傷創(chuàng)面壞死組織的分解和脫落。許多研究已證實殼聚糖通過調(diào)節(jié)中性粒細胞與巨噬細胞來促進燒傷創(chuàng)面的愈合。

3.3 雌激素 Hsieh等［15］報道，雌激素體內(nèi)應(yīng)用可通過增加創(chuàng)傷失血動物Kupffer細胞的Akt磷酸化水平，維持其Fc受體及ATP含量，進而逆轉(zhuǎn)其受抑的吞噬能力，并使其外周血清中升高的TNF-α、IL-6和IL-10水平趨于正常。相反，同時應(yīng)用雌激素受體拮抗劑ICI 182，780、PI3K抑制劑Wortmannin則可消除雌激素的上述保護效應(yīng)。

3.4 興奮迷走神經(jīng) 提高迷走神經(jīng)興奮性旨在增加迷走神經(jīng)信號輸出，改變免疫細胞的炎性調(diào)定點，調(diào)整損傷后的炎性應(yīng)答。Lopez等［4］在觀察到燒傷小鼠體內(nèi)腹腔巨噬細胞處于高活化狀態(tài)的同時，嘗試興奮迷走神經(jīng)對其干預(yù)效應(yīng)。發(fā)現(xiàn)興奮燒傷組小鼠迷走神經(jīng)可有效降低巨噬細胞在LPS刺激下的p65Ser536磷酸化水平，進而確定了迷走神經(jīng)興奮對阻斷腹膜巨噬細胞活化減輕炎癥反應(yīng)具有保護作用。探究迷走神經(jīng)信號通路在抗炎中的作用已經(jīng)顯示出極大的臨床可行性。

3.5 siRNA策略 通過對燒傷小鼠粒細胞單核細胞前體細胞(GMP)來源的單核細胞進行siRNA轉(zhuǎn)染以沉默MafB表達，則可提高GATA-1表達水平并部分恢復(fù)燒傷動物的單核細胞向樹突狀細胞分化的能力［6］。

4 展望

深入研究創(chuàng)傷/燒傷后單核－巨噬細胞功能紊亂的分子機制對于開發(fā)新型免疫調(diào)節(jié)策略無疑具有重要的臨床意義。但目前臨床上對于傷后單核－巨噬細胞數(shù)量及功能監(jiān)測多采用外周血單核細胞，而對機體巨噬細胞的功能監(jiān)測因取材困難常不能實施。事實上巨噬細胞的異質(zhì)性決定了不同部位的巨噬細胞在傷后表現(xiàn)為不同的變化特征，而外周血中單核細胞功能的監(jiān)測結(jié)果只能反應(yīng)單核-巨噬細胞功能的一個側(cè)面。加之創(chuàng)傷后的不同階段可致單核－巨噬細胞發(fā)生由“激活”到“失活”、由“促炎”向“抗炎”的轉(zhuǎn)變，從而使得臨床上單方面實施“免疫抑制”或“免疫增強”策略變得無所適從。目前對創(chuàng)傷/燒傷后單核-巨噬細胞功能變化的分子機制研究尚不夠深入，故相應(yīng)的調(diào)節(jié)措施存在著“逆轉(zhuǎn)某一個或幾個指標變化”的局限性。推測未來的發(fā)展趨勢可能包括以下幾個方面:(1)研發(fā)新型的免疫檢測手段，以全面、客觀、適時地反映機體傷后的免疫應(yīng)答水平;(2)應(yīng)用現(xiàn)代免疫學(xué)及分子生物學(xué)新技術(shù)揭示創(chuàng)傷后免疫功能紊亂的精細調(diào)節(jié)機制;(3)以是否能改善傷者預(yù)后(如降低傷后膿毒癥及多器官功能衰竭發(fā)生率)及提高生存率為標準來評估免疫調(diào)節(jié)策略的有效性。相信隨著研究的深入，創(chuàng)傷/燒傷后單核-巨噬細胞功能失衡的分子機制將不斷被揭示，新型有效的免疫調(diào)節(jié)策略將不斷被發(fā)掘。

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