睪穿精畸形部位對ICSI 受精及胚胎發育的影響

于成和，阿周存，張若鵬，吳 睿，張麗蓉，朱 莉

（大理大學附屬醫院 生殖醫學科，云南 大理 671000）

ICSI 技術（Intracytoplasmic Sperm Injection）即卵泡漿內單精子注射，1992 年Palerml 首次對人卵子進行ICSI 操作，成功得到了首例ICSI 嬰兒[1]，1996 廣州中山醫科大學第一附屬醫院生殖中心為一對少精癥不育夫婦助孕成功生下一女嬰，成為我國第一例ICSI 嬰兒，為我國ICSI 行業做出突破性的貢獻。然而影響ICSI 技術的因素很多：精子因素、卵子因素、技術操作、體外環境等。活精子、死精子、不運動的精子、附睪精子和睪丸精子都可被用于ICSI 操作[2]。

世界衛生組織出版的《 人類精液檢驗與處理實驗室手冊》（第五版）[3]規定人類精子畸形（Sperm Malformation Rate，SMR）分類：一、頭 部（錐形、梨形、圓形、無頂體、小、無定形、有空泡、頂體區域小），二、頸部和中段的畸形（頸部彎折、不對稱、中段和頭部連接點粗、細），三、尾部畸形（短尾、成角彎折、卷尾、過多的胞漿殘余體、精子頭部大小的1/3）。本實驗研究睪丸穿刺所獲得正常形態、頭部畸形、頸部畸形、尾部畸形的精子行ICSI，分析不同畸形部位對受精、胚胎發育的影響。

資料與方法 2012 年1 月－2014 年12 月，在大理大學附屬醫院生殖醫學科經患者簽署《 大理大學附屬醫院生殖醫學科未成熟配子、廢棄卵子、廢棄胚胎的處理意向書》并選擇用于科學研究的未成熟卵子，經體外培養成熟，玻璃管化冷凍累計達213 枚，玻璃管化解凍后存活194 枚。精子來源于我科室并簽署上述協議所廢棄的梗阻性無精患者（染色體分析正常）睪丸穿刺所獲得精子。

實驗分組：實驗分為四組，形態正常組、頭部畸形組、頸部畸形組、尾部畸形組，分別對應注射正常形態、頭部畸形、頸部畸形、尾部畸形睪丸穿刺精子。將上述復蘇得194 枚卵子隨機分為4 組，每組數目分別為48 枚、49 枚、49 枚、48 枚，并標記為形態正常組、頭部畸形組、頸部畸形組、尾部畸形組。

ICSI 注射：上針，配注射盤 先上Holding 針，再上注射針，調節Holding 針和注射針的平面。根據卵子多少，用M-HTF 液制成若干小圓形液滴，中央加入PVP，右邊緣用M-HTF 液制成長條形液滴，迅速覆蓋油，使液面全部覆蓋。并將卵子吸入小圓形液滴內，精子吸入長條形液滴內。

ICSI 操作：將單個活動的精子吸入PVP 中，在精子尾部1/3 處制動，精子吸入顯微注射針內，轉動卵子使得紡錘體區處于6 或12 點鐘位置，其3 點鐘位置用Holding 針將卵子固定，將精子推至注射針尖口，將針從卵子的9 點鐘方向插入卵子，抽吸胞漿至觀察到胞質流動突然加劇，停止抽吸并以正壓將精子頭注入卵胞漿內再以輕微的負壓小心抽出顯微注射針，隨后Holding 針釋放卵子。每組注射結束后，轉移至與之相對應標記的生長皿中，放入5%CO2培養箱中培養。

受精與胚胎觀察：授精后16～18h 觀察并記錄受精（記為D1），43～45h 觀察并記錄胚胎分裂（記為D2），67～69h 觀察并記錄胚胎發育（記為D3），114～164h 根據囊胚形成情況觀察并記錄囊胚形成（記為D5-D7）。

統計分析：應用SPSS17.0 統計軟件進行數據分析，采用精確概率法的雙側χ2檢驗，P＜0.05有統計學差異。

結 果 與形態正常組相比，頭部畸形組的受精率（42.86VS64.58）、2PN 受精率（36.73VS60.42）顯著性下降（P＜0.05），但對胚胎發育的影響無顯著性差異；頸部畸形組的受精率、胚胎發育都無顯著性下降；尾部畸形組的受精率（54.17VS 64.58）下降，但無統計學意義，該組胚胎發育無顯著性下降。

討 論 精子在男性睪丸中產生，在附睪中成熟，經輸精管運輸至精囊并儲存其中，以性交、遺精、手淫取精等方式排出體外。精子發生及成熟過程中發生形態異常機制可能有：活性氧產生的增多、精子的異常凋亡、染色質異常、免疫性損傷。精子頭部是遺傳物質所在部位。尾部主要成分是細胞質，在自然受精過程，主要起運動功能。頸部是連接頭部和尾部的結點，具體功能尚未清楚。謝文燕等研究表明人精子染色質的狀態與其形態明顯相關，頭部形態異常的精子其染色體異常的幾率要比正常精子染色體異常的幾率高4倍[4]。精子畸形率高的患者行IVF 時，其受精率、流產率降低，然而楊帆等[5]報道挑選正常形態的精子行ICSI 時受精率、胚胎發育與正常形態率的精子無差別，但形態異常精子使受精率和臨床妊娠率均低于精子形態正常的患者。目前對精子形態異常對輔助生殖技術的影響，國內外報道尚未一致，多數研究結果[6]表明，基于形態學和功能的精子優選技術有理論上的價值，但對于ICSI 的臨床結局并沒有顯著的改善。

附表 睪丸精畸形部位對ICSI受精及胚胎發育的影響

ICSI 技術影響因素很多，本實驗在確保其他條件相同的情況下，研究睪穿精子的不同畸形部位對復蘇卵子ICSI 受精及胚胎發育的影響。卵子經過冷凍、液氮低溫保存、復蘇后，受精率及胚胎質量不及新鮮卵子，冷凍復蘇過程對卵子造成一定程度損傷。有學者認為睪丸精子受精率比附睪精子低，但睪丸、附睪及射出精子ICSI 后妊娠結局無顯著差異，可能存在后期自我修復[7]。在臨床工作中，睪丸穿刺所獲得的精子未經過附睪等部位的發育與成熟，精子活動力、活動率差，精子密度低，畸形率極高，對于部分患者挑選出一條形態正常的活精子十分困難。因此在睪丸穿刺術+ICSI 術臨床應用中，我們盡可能挑選形態正常的活動精子注入，但如果找不到正常形態的活精子，可首先挑選頸部畸形的精子，其次再挑選尾部畸形的精子，最后再考慮頭部畸形的精子，以減少精子形態對受精、胚胎的影響。

［1］PALERMO G,JORI H,DEVROEY P,et al.Pregnancies after intracytoplasmic injection of single spermatozoom into an oocyte[J]．Lancet,1992,340,17-18.

［2］嚴阿勇，李明，安曉榮，等．胞漿內精子注射技術生產小鼠[J]．生物工程學報，2005,21(2)：305-309.

［3］World Health Organization.WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen. 5th ed[M]．Geneva：World Health Organization,2010.66-67．

［4］謝文燕．畸形精子癥精液的處理方法及精子形態對輔助生殖技術治療結局影響的研究[D]．汕頭：汕頭大學，2007.

［5］楊帆．精子形態對輔助生殖結果影響的相關研究[D]．河北：河北醫科大學，2014.

［6］胡燁，滕曉明．精子優選技術的進展及其對卵細胞質內單精子注射結局的影響[J]．診斷學理論與實踐，2014,13(3)：341-344.

［7］朱海波．精子質量相關因素對ICSI 助孕結局影響的初步分析[D]．吉林：吉林大學，2014.