犬細小病毒PCR 檢測方法的建立

黃雪梅 廣西北海市海城區(qū)潿洲鎮(zhèn)漁牧獸醫(yī)站 536004

犬細小病毒（CPV）是在1978年首次發(fā)現(xiàn)，隨后在全世界范圍內(nèi)流行，因此有關該病毒的研究工作開展得較晚。

為了進一步解決CPV 在臨床上的快速診斷問題,針對VP2 基因設計特異引物[2]，預擴增片段大小990 bp，并通過條件優(yōu)化試驗確定合適退火溫度、引物濃度、合適Mg2+濃度等，建立一個特異性好、敏感度高、快速簡便檢測CPV 核酸的PCR 方法。

1 實驗材料與設備

疑似犬細小病毒病的犬糞便、犬細小病毒CPV、犬流感病毒CIV、犬瘟熱病毒CDV，以及犬副流感病毒CPIV、緩沖液、Taq DNA 聚合酶、dNTPs(each 10 mmol/L)、dNTPs(each 2.5mmol/L)、DL2000 DNA Marker 、實驗儀器等。

2 實驗方法

（1）引物合成。根據(jù)GenBank 中登錄的犬細小病毒序列[DQ903936],針對其VP2 基因,設計引物:CPV上游引物5-GTTCTGGGGGTGTGGGGATTT-3；下游引物5-CTCCCCCCCGTCCTGCTGCAA-3，預擴增片段大小990bp。用ddH2O 將引物稀釋為20μmol/L，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）目的基因產(chǎn)物的PCR 擴增。將以上成分混勻后，在UNO-II 型核酸擴增儀運行。運行程序如下。

表1 在25μ 的PCR 擴增體系中加入如下成分

（3）PCR 產(chǎn)物電泳檢測。取PCR 產(chǎn)物5μL 加入Loading Buffer 1μL 混勻，加到1%瓊脂糖凝膠的點樣孔中，并設置分子量參照標準DNA Marker DL2000。先用100V 電壓，50mA 電流進行電泳，待PCR 產(chǎn)物進入凝膠后，再以80V 電壓，40mA 電流繼續(xù)電泳，直到PCR 產(chǎn)物進入凝膠一定距離后（約30min），再進行凝膠成像拍照分析。

（4）特異性實驗。根據(jù)建立的犬細小病毒PCR 檢測方法，抽提犬流感病毒RNA、犬瘟熱病毒DNA，以及犬副流感病毒RNA，并進行反轉錄制備模板加入到犬瘟熱病毒RT-PCR 反應體系中進行擴增，同時設陽性對照，對PCR 產(chǎn)物進行電泳，檢測該方法的特異性。

（5）敏感性實驗。抽提病毒DNA，運用核酸蛋白測定儀進行DNA 含量測定，定量的DNA 依10 倍梯度依次進行稀釋，將稀釋后的DNA 進行PCR 反應，對PCR 產(chǎn)物進行電泳，檢測該方法的敏感性。

（6）臨床樣品檢測。對疑似犬細小病毒病的15例犬糞便進行臨床檢測。

3 結果

（1）特異性實驗結果。分別以犬瘟熱病毒（CDV）、犬流感病毒（CIV）、犬細小病毒(CPV)和犬副流感病毒(CPIV)作為樣品，同時設立陰性對照作PCR 特異性檢測，結果以CPV 陽性樣品為模板的泳道出現(xiàn)明顯的大小約為990bp 的擴增產(chǎn)物，其他樣品呈陰性。結果表明，引物對CPV 具有專一性，可區(qū)分與犬細小病毒癥狀相似的一些疾病。

（2）敏感性檢測結果。運用建立的犬細小病毒PCR 方法對犬細小病毒進行敏感性檢測。結果該引物對犬細小病毒DNA 的最低檢出量達到10pg，表明該檢測方法對病毒目的基因擴真具有很高的敏感性。

（3）臨床樣品檢測。在15 例疑似犬細小病毒的臨床病料檢測中，能夠檢測出特異性病毒的結果顯示，有13 例出現(xiàn)大小約為990bp 擴增片段，陽性檢出率約為86.66%。

通過針對VP2 基因設計特異引物,成功建立了特異性好、敏感度高、快速簡便檢測CPV 核酸的PCR方法。

94℃3min，1 個循環(huán)。94℃1 min，55℃1 min，72℃90s；30 個循環(huán)。72℃8min，1 個循環(huán)。

在PCR 擴增程序運行時，設立不加模板的陰性對照。反應結束后，取3μL PCR 產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠(含0.5μg/mL EB)進行電泳檢測。

[1]劉忠華,鐘翎,賀星亮,等.用PCR 技術鑒定犬細小病毒弱毒疫苗株[J].中國獸醫(yī)學報,2003,23(5):444-446.

[2]楊德威,宋延華,劉福安.應用套式PCR 在MDCK 細胞系中發(fā)現(xiàn)犬細小病毒[J].華南農(nóng)業(yè)大學學報,2000,21(3):81-82.