高效液相凝膠過濾色譜法測定注射用烏司他丁中烏司他丁的含量*

甘惠貞，林淑瑜，潘丹婷，楊昌云

(解放軍第180醫院藥學科，泉州 362000)

高效液相凝膠過濾色譜法測定注射用烏司他丁中烏司他丁的含量*

甘惠貞，林淑瑜，潘丹婷，楊昌云

(解放軍第180醫院藥學科，泉州 362000)

目的 建立高效液相凝膠過濾色譜法測定注射用烏司他丁中烏司他丁的含量。方法 色譜柱：凝膠柱TSKgel G3000SWxl(7.8 mm×300 mm，5 μm)；流動相：[0.001 mol·L-1磷酸二氫鈉-0.001 mol·L-1磷酸氫二鈉(39：61)]-乙腈(90：10)；流速0.7 mL·min-1；檢測波長280 nm；柱溫25 ℃；進樣量20 μL。結果 烏司他丁的檢測質量濃度線性范圍為0.781 25～50.00 U(r=0.999 9)；低、中、高劑量樣品平均回收率分別為100.32%，100.17%，100.21%，RSD分別為0.633%，0.568%，0.414%(n=3)。結論 該法簡便、快速，結果準確，可用于烏司他丁的含量測定。

烏司他丁；含量測定；色譜法，凝膠過濾，高效液相

烏司他丁是肝臟分泌的一種具有廣譜蛋白酶抑制作用的糖蛋白，屬于人體內源性抗炎物質，能夠抑制胰蛋白酶、α-糜蛋白酶和粒細胞彈性蛋白酶等多種蛋白水解酶的活性，促進酶的降解[1]。注射用烏司他丁是從新鮮人尿中分離純化的尿胰蛋白酶抑制藥，為糖蛋白，含有143個氨基酸，相對分子質量約67 000，是一種典型的Kuniz型的蛋白酶抑制藥[2]，目前臨床上廣泛應用于急慢性胰腺炎，各種休克及各種大手術時的臟器功能保護。注射用烏司他丁在水溶液中穩定性差，為了確保藥品的質量，采用高效液相凝膠過濾色譜法，測定注射用烏司他丁中烏司他丁的含量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Ultimate3000高效液相色譜儀(戴安中國有限公司)，JA2003電子分析天平(上海方瑞儀器有限公司，感量：1 mg)，PHS-3C型實驗室pH計(上海誠寧環保科技有限公司)，注射器，移液槍。

1.2 試藥 烏司他丁標準品(中國食品藥品檢定研究院，批號：140785-201001)，注射用烏司他丁(廣東天普生化醫藥股份有限公司，規格：每瓶10萬U，批號：031304023，031308014，031309113)，乙腈(美國Fisher公司，色譜純)，磷酸二氫鈉(美國MREDA，色譜純)，磷酸氫二鈉(美國MREDA，色譜純)，水為超純化水(本院消毒供應室提供)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：TSKgel G3000SWxl(7.8 mm×300 mm，5 μm)；流動相：[0.001 mol·L-1磷酸二氫鈉-0.001 mol·L-1磷酸氫二鈉(39：61)]-乙腈(90：10)；流速0.7 mL·min-1；柱溫25 ℃；檢測波長280 nm；進樣量20 μL。注射用烏司他丁的輔料為甘露醇、氯化鈉、磷酸緩沖溶液，在該色譜條件，輔料無吸收峰，不會干擾注射用烏司他丁的含量測定。

2.2 溶液的制備

2.2.1 標準品溶液的制備 取烏司他丁標準品1瓶(100 000 U)，置10 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，避光、室溫下保存。

2.2.2 供試品溶液的制備 模擬臨床使用方法實際常用濃度配制，取注射用烏司他丁1瓶(100 000 U)加入10 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，作為母液。再取母液2 mL置100 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，得濃度為200 U·mL-1的供試品溶液。

2.3 專屬性實驗 ①酸破壞：按照標準品溶液制備方法制備200 U·mL-1烏司他丁標準品溶液，加鹽酸調pH<2，放置4 h后，用氫氧化鈉溶液調pH至中性。②堿破壞：加氫氧化鈉溶液調pH>10，放置4 h后，用鹽酸調pH至中性。③光照破壞：強光(4 500 lx)照射4 h。④加熱破壞：37 ℃水浴加熱4 h后，冷卻。分別將以上破壞后的標準品溶液按“2.1”項下色譜條件進樣測定。破壞實驗結果見圖1。本品經酸、堿破壞后與標準品譜圖比較，都有明顯的降解產物生成，所產生的雜質與烏司他丁分離度良好；光照、加熱破壞實驗無新的物質生成。因此通過專屬性實驗可得出烏司他丁對酸、堿不穩定。

2.4 線性關系考察 分別精密吸取一定量烏司他丁標準品溶液，稀釋制成濃度分別為39.06，78.12，156.25，312.50，625.00，1 250.00，2 500.00 U·mL-1的溶液。在色譜條件下，分別進樣20 μL。以標準品質量U(X)為橫坐標，峰面積(A)為縱坐標，進行線性回歸，得標準曲線方程A=0.253 2X-0.001 7，r=0.999 9，結果表明烏司他丁在0.781 25～50.00 U范圍內與其峰面積有良好的線性關系。

2.5 精密度實驗 制備高、中、低濃度的烏司他丁標準品溶液(1 250，625，312.5 U·mL-1)各3份，同日測定并連續測定5 d，計算峰面積，得高、中、低濃度的日內精密度RSD分別為0.83%，0.61%，0.46%；日間精密度RSD分別為0.63%，0.70%，0.59%，結果表明精密度良好。

2.6 重復性實驗 取同一批(批號：031304023)樣品，按照“2.2.2”供試液制備方法制備200 U·mL-1烏司他丁供試品溶液6份，進樣，測得峰面積 RSD=0.51%，結果表明重復性良好。

2.7 加樣回收率實驗 取已知含量的注射用烏司他丁(批號：031304023)，精密稱定，加溶劑溶解制成烏司他丁含量為 200 U·mL-1的溶液，分成 3 組，分別精密加入3種劑量烏司他丁標準品，制成濃度分別為360，400，440 U·mL-1的樣品溶液，取 20 μL進樣，各測定3次，取平均值，計算回收率和RSD，結果見表1。

2.8 穩定性實驗 取同一份供試液(批號：031304023)，分別于0，2，4，6，8，24 h進樣分析，根據烏司他丁的峰面積計算，得RSD為0.18%(n=6)，結果表明穩定性良好。

2.9 供試品含量測定 取3個批號的注射用烏司他丁10萬U。每個批號的藥品按照供試品溶液的配制方法進行配制成2 00 U·mL-1的溶液，在“2.1”項下色譜條件下進樣20 μL測定，分別測定5次。含量測定結果顯示(表2)，3個批號樣品烏司他丁含量分別相當于標示含量的100.16%，101.04%，100.55%，均達到藥品含量的要求。

3 討論

參考2010年版《中華人民共和國藥典》[3]，烏司他丁及有關物質的含量測定方法采用分子排阻色譜法，使用凝膠色譜柱TSKgelG3000SWxl(7.8 mm×300 mm，5 μm)，以磷酸鹽緩沖液(取磷酸二氫鈉6.90 g、磷酸氫二鈉 17.91 g及氯化鈉8.77 g，加水800 mL溶解，調節pH為6.8，加水至1 000 mL)為流動相，流速為0.7 mL·min-1，檢測波長為280 nm。理論板數按烏司他丁峰計算不低于800。本品為大分子多肽類糖蛋白，因此需選擇適用于分離本品的凝膠色譜柱TSKgelG3000SWxl(7.8 mm×300 mm，5 μm)。參考近年來有關凝膠色譜柱實驗的相關文獻[4-5]，所使用的磷酸鹽濃度均較低，且加入一定量乙腈，在《中華人民共和國藥典》測定方法的基礎上調整磷酸鹽濃度及其與有機溶劑的比例，最終以[0.001 mol·L-1磷酸二氫鈉-0.001 mol·L-1磷酸氫二鈉(39：61)]-乙腈(90：10)為流動相進行實驗。烏司他丁的峰寬從1.439 min下降至0.203 min，柱效從904提高至23 181。凝膠色譜柱所承受的壓力不宜過大，流速減小可降低柱壓，而流速過小，保留時間過長亦不適宜，兼顧兩方面因素，選擇0.5，0.7 mL·min-1進行對比實驗。結果表明流速選擇為0.7 mL·min-1較為適宜。

表2 注射用烏司他丁含量測定結果

本實驗建立的方法簡便、快速、準確，可用作注射用烏司他丁的含量測定。

[1] 鄧志會，李波，肖徽，等.高效液相凝膠過濾色譜法測定沙蠶金屬蛋白酶的純度[J].齊齊哈爾醫學院學報，2011，32(21)：3505.

[2] 陳漢明，鄭偉鋼.烏司他丁對ALI/ARDS患者療效分析[J].中國社區醫師，2013，15(1)：57-58.

[3] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)[M].北京：中國醫藥科技出版社，2010：64-65.

[4] 褚良，張哲.鹽酸頭孢替安酯的聚合物檢查方法的建立與驗證[J].哈爾濱醫藥，2012，32(3)：171-172.

[5] 王成剛，周立春，王俊秋.高效分子排阻色譜法分析注射用頭孢噻吩鈉中的高分子雜質[J].中國藥品標準，2010，11(5)：340-342.

DOI 10.3870/yydb.2015.06.031

2014-02-12

2014-07-17

*醫院基金課題項目(11D3007)

甘惠貞(1973-)，女，福建漳州人，主管藥師，學士，研究方向：藥房管理。電話：0595-28919451，E-mail：13599220436@139.com。

楊昌云(1973-)，男，江西萍鄉人，副主任藥師，學士，研究方向：醫院藥學。電話：0595-28299531，E-mail：yidalsy2005@163.com。

R982；R927.2

B

1004-0781(2015)06-0814-03