具有近紅外熒光的二氧化鈦納米粒的載藥與體外釋放*

應景艷，徐愛仁，戎建輝，馬衛成，何文躍

(浙江省寧波市泌尿腎病醫院藥劑科，寧波 315100)

具有近紅外熒光的二氧化鈦納米粒的載藥與體外釋放*

應景艷，徐愛仁，戎建輝，馬衛成，何文躍

(浙江省寧波市泌尿腎病醫院藥劑科，寧波 315100)

目的 制備具有近紅外熒光的納米二氧化鈦(TiO2)，并考察納米粒的載藥及體外釋放性能。方法 通過水熱法合成摻雜釤的TiO2(Sm-TiO2)，采用透射電鏡(TEM)對其進行表征，測定其熒光光譜，并考察對多柔比星(DOX)的載藥量及體外釋放曲線。結果 所制備的納米粒分散均勻，外觀呈梭狀，長度100～200 nm，發射波長640～670 nm，在水中的載藥量達11.5%，體外釋放具有pH敏感性。結論 所制備Sm-TiO2有良好的近紅外熒光發光效果、較高的載藥量及可控的體外釋放，可以作為新型藥物載體深入研究。

二氧化鈦(TiO2)；藥物載體；釋放，pH敏感；近紅外熒光

腫瘤是危害人類生命健康的主要疾病之一，其治療一直是醫藥研究領域的難題。盡管新型納米給藥系統，如膠束、脂質體、納米粒、樹狀大分子等的出現在一定程度上改善治療效果，但仍存在體內過程難以實時監測等問題。近年來，隨著納米技術的發展及活體成像技術的出現，使載體的體內過程監控成為可能。活體成像技術是指利用靈敏的光學檢測儀器，直接監測活體生物體內具有熒光的細胞活動和基因行為的技術。通過此項技術，可以直觀的觀測特定基因的表達、腫瘤的生長及轉移等生物學過程。其對光的波長有一定要求，波長在650～950 nm及1 050～1 300 nm范圍內的光具有較好的組織穿透能力，有利于活體成像[1]。二氧化鈦(TiO2)作為一種新型功能納米材料，具有良好的生物相容性，通過稀土離子摻雜后在近紅外區具有熒光效應，可用于活體成像，此外其還具有較高的表面積(300 m2·g-1)[2]，可負載大量的藥物；同時由于其具有超聲敏化功能，在超聲作用下產生活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，從而可以殺傷腫瘤細胞[3-4]。因此筆者擬構建稀土離子摻雜的納米二氧化鈦，并以其作為藥物載體，實現藥物定向傳輸。

1 材料與方法

1.1 藥品與試藥 四氯化鈦(TiCl4，批號：20130315)、氨水(批號：T20100118)均為分析純(國藥化學試劑有限公司)；六水合硝酸釤(SmN3O9·6H2O，阿拉丁試劑有限公司，批號：37198，)；鹽酸多柔比星(DOX，北京華奉聯博科技有限公司，批號：HF100519，含量>98.0%)；鹽酸多柔比星對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：130509-200301，含量99.5%)；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器 JEM-1200EX透射電子顯微鏡(日本JEOL公司)；FP 6500熒光分光光度儀(日本JASCO公司)；TU-1800PC紫外-可見分光光度儀(北京普析通用儀器有限公司)；TGL-168高速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)；SRJX箱式電爐(上海錦屏儀器儀表有限公司)。

1.3 釤摻雜TiO2(Sm-TiO2)的制備 通過TiCl4水解的方法制備納米粒。稱取SmN3O9·6H2O 0.06 g溶于去離子水100 mL中，待完全溶解后，快速攪拌下加入TiCl42 mL，繼續攪拌10 min，生成納米TiO2前驅體，攪拌下加入氨水調節pH至9.3，繼續攪拌30 min，離心洗滌數次后，轉移至內襯聚四氟乙烯的不銹鋼反應釜中進行水熱反應，220 ℃反應3 h后，自然冷卻至室溫，取出后洗滌3次，60 ℃干燥，然后轉移至馬弗爐中350 ℃煅燒2 h。所得產物形態利用透射電鏡(transmission electron microscope，TEM)進行觀察，熒光光譜利用熒光分光光度計在365 nm激發光下測定。

1.4 DOX標準曲線的制備 取DOX對照品，配制2，5，10，20，50，100 μg·mL-1的溶液，分別在488 nm波長處測定吸光度，繪制標準曲線。由曲線得到濃度與吸光度的函數方程為C=57.958A-0.230 5，其中C為DOX溶液的濃度(μg·mL-1)，A為488 nm波長條件下所測得的吸光度，擬合優度r=0.999 6，說明DOX在2～100 μg·mL-1范圍內具有良好線性關系。

1.5 DOX的負載 將一定濃度的 DOX與0.4 mg·mL-1的Sm-TiO2在pH 5.0，6.5，7.4磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)及水中攪拌過夜，然后9 600×g離心10 min去除未結合的DOX，所得物用PBS洗滌數遍，直到上清液完全無色，所得物(標記為DOX -TiO2)重懸后4 ℃ 保存。上清液合并收集，用紫外分光光度儀488 nm波長測定吸光度，根據標準曲線計算載藥量。

1.6 DOX -TiO2納米粒的體外釋放研究 精密稱取DOX -TiO2納米粒適量，分別分散于pH 5.0，6.5，7.4介質中，配置成1 mg·mL-1溶液，在37 ℃下恒溫振蕩(100 r·min-1)進行體外釋放考察，分別在1，2，4，6，8，10，20 h時間點取樣，9 600×g離心10 min，取出上清液，同時補充新鮮釋放介質，上清液于488 nm波長測定吸光度計算釋放百分率。

2 結果

2.1 Sm-TiO2的形貌表征 利用TEM對Sm-TiO2納米粒的形態進行表征，Sm-TiO2外觀呈類梭狀，分散良好，無明顯團聚現象(圖1)，其長度為100～200 nm，寬度為30～50 nm，載藥后，Sm-TiO2納米粒形態未發生明顯變化。利用熒光分光光度計測定Sm-TiO2納米粒的熒光光譜(圖2)，結果顯示納米粒在590～620 nm及640～670 nm均有明顯熒光，所發出的熒光具有良好的強度，肉眼可見(圖3)，且載藥對其熒光強度無明顯影響。

Fig.1 Transmission electron microscopy(TEM)image of Sm-TiO2

2.2 DOX的負載 結果見圖4。隨著pH的增加，在相同DOX濃度條件下，TiO2的載藥量顯著增加。同時DOX在水中仍具有良好的負載性能，載藥量達到11.5%。由于DOX在水中較易溶解，因此以水作為負載介質。DOX濃度對載藥量的影響結果見圖5。隨著藥物濃度的增加，載藥量呈非線性增加，當DOX濃度超過100 μmol·L-1時，載藥量增加緩慢，因此可以選擇100 μmol·L-1作為負載濃度。載藥后，由于DOX的吸附，TiO2納米粒由白色轉變為紅色(圖6)，高速離心(10 000 r·min-1，10 min)后，DOX-TiO2聚集到離心管底部，上清液呈無色透明，說明DOX完全吸附到納米粒表面。

圖3 Sm-TiO2在白光及紫外激發下的熒光照片

Fig.3 Fluorescence photograph of Sm-TiO2under white light and UV

2.3 DOX的釋放 DOX-TiO2在不同pH條件下隨時間變化的體外釋放結果見圖7。從圖7可以看出，藥物釋放的快慢與介質的pH有關，隨著pH的降低，藥物釋放加快，在pH5.0介質中，20 h累積釋放接近70%，這主要與DOX在酸性條件下溶解度較好有關。

3 討論

本研究運用水熱法合成稀土摻雜的Sm-TiO2，得到分散良好、長度為100～200 nm的梭狀納米粒，并利用熒光分光光度計對該納米粒的熒光光譜進行測定，結果顯示波長在590～620 nm及640～670 nm均有明顯熒光。波長大于650 nm的光具有良好的組織穿透性，因此Sm摻雜的TiO2納米粒在生物成像方面具有一定的應用前景。

Fig.4 Drug loading capacity of DOX in water and PBS with different pH

Fig.5 Effect of different concentration of DOX on its drug loading capacity

圖7 在不同pH緩沖液中DOX從DOX-TiO2的釋放曲線

Fig.7 Release curve of DOX from DOX-TiO2in buffers at different pH values

本實驗中，隨著pH的增加，在相同DOX濃度條件下，TiO2的載藥量顯著增加，這主要是由于DOX在酸性條件下溶解度較高，當pH降低時DOX以解離狀態存在，DOX與TiO2之間的疏水作用力減弱，因此載藥量降低，當pH較高時，DOX疏水性增加，其與TiO2之間的疏水作用力隨之增加，因此載藥量增加[5-6]。

體外釋放結果表明介質的pH對DOX-TiO2的體外釋放具有明顯影響，pH越低藥物釋放越快。人體正常微環境的pH約為7，而大多數癌細胞組織外、細胞內溶酶體等的微環境是酸性的，有利于DOX的釋放，因此，有很多pH依賴性釋放的報道，以達到藥物在靶部位定向釋放的目的。如SHEN等[7]利用聚電解質膠囊負載DOX，通過pH控制藥物釋放；XIE等[8]將DOX負載與介孔二氧化硅，并通過調節pH控制藥物釋放速率。這種pH敏感釋放特性能夠促進藥物在腫瘤低pH環境下釋放，從而發揮更好地腫瘤抑制作用。

本研究制備的納米粒同時具有成像和載藥雙重性能，靜脈注射進入體內后，可通過熒光觀察其體內分布情況，以便了解載體對腫瘤的靶向性，同時載體在腫瘤部位可實現pH敏感釋放，將有利于腫瘤的治療。目前，將載體同時應用于成像及藥物傳遞的研究已有較多報道，如NaYF4[9]、CdSe[10]等，但以TiO2作為成像及載體的研究相對較少。此外，由于TiO2具有良好的光催化及超聲催化性能，因此進一步探討載藥納米粒的催化治療與化療聯合應用，對該載體在抗腫瘤方面研究具有重要意義。

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DOI 10.3870/yydb.2015.06.025

Drug Loading and Release of Titanium Dioxide Nanoparticles with Near-infrared Light

YING Jingyan, XU Airen, RONG Jianhui, MA Weicheng, HE Wenyue

(DepartmentofPharmacy,RenopathyandUrologyHospitalofNingboCity,ZhejiangProvince,Ningbo315100,China)

Objective To prepare titanium dioxide (TiO2) nanoparticles with good near-infrared light and study the loading and release of doxorubicin. Methods The Sm doped TiO2nanoparticles (Sm-TiO2) were synthesized using a modified solvothermal reaction and then observed with transmission electron microscope.The fluorescence spectrum, doxorubicin loading capacity and release profile were also determined. Results The obtained Sm-TiO2nanoparticles with the length from 100-200 nm were fusiform and well dispersed.The emission wavelength was 640-670 nm.The drug loading capacity in water was 11.5%.DOXinvitrowas pH sensitive to release. Conclusion Sm-TiO2nanoparticles have good near-infrared light, high drug loading capacity and controllable drug release are obtained and should be studied further more as a novel carrier.

Titanium dioxide (TiO2)； Drug carrier； Release, pH sensitivity； Near-infrared light

2014-02-24

2014-09-14

*寧波市自然科學基金資助項目(2012A610182)

應景艷(1983-)，女，浙江寧波人，主管藥師，碩士，從事臨床藥學工作。電話：0574-83039130，E-mail：ffxfly@163.com。

何文躍(1971-)，男，浙江舟山人，副主任藥師，主要從事藥物新制劑研究。電話：0574-83039130，E-mail：hwy710331@sina.com。

R945

B

1004-0781(2015)06-0795-04