高效液相色譜法測(cè)定板藍(lán)根顆粒中(R，S)-告依春的含量*

鞏偉，劉忠良，趙慶華，文鳳娥，李鵬，張琨，趙梅

(濟(jì)南軍區(qū)聯(lián)勤部藥品儀器檢驗(yàn)所，濟(jì)南 250022)

高效液相色譜法測(cè)定板藍(lán)根顆粒中(R，S)-告依春的含量*

鞏偉，劉忠良，趙慶華，文鳳娥，李鵬，張琨，趙梅

(濟(jì)南軍區(qū)聯(lián)勤部藥品儀器檢驗(yàn)所，濟(jì)南 250022)

目的 建立高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定板藍(lán)根顆粒中(R，S)-告依春的含量并討論含量限度。方法 色譜柱為SHIMADZU VP-ODS柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-0.02%磷酸溶液(7：93)，流速1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長為245 nm，自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣，進(jìn)樣量10 μL。分別依照轉(zhuǎn)移率、測(cè)定結(jié)果統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)討論含量限度。結(jié)果 (R，S)-告依春在0.058 7～150.349 5 μg·mL-1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.999 7，n=7)，低、中、高加入量平均回收率分別為98.72%，98.40%，98.60%，RSD分別為1.84%，0.50%，1.82%。依照轉(zhuǎn)移率、測(cè)定結(jié)果統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)確定含量限度存在問題。結(jié)論 該法操作方便、結(jié)果準(zhǔn)確，精密度好，專屬性強(qiáng)，可用于板藍(lán)根顆粒的質(zhì)量控制；(R，S)-告依春的含量限度應(yīng)依據(jù)藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)數(shù)據(jù)確定。

板藍(lán)根顆粒；(R，S)-告依春；含量限度；色譜法，高效液相

板藍(lán)根顆粒具有清熱解毒、涼血利咽功效，其現(xiàn)行法定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為《中華人民共和國藥典》2010年版第二增補(bǔ)本[1]，檢驗(yàn)項(xiàng)目包括鑒別、檢查等，無含量測(cè)定。研究表明，板藍(lán)根抗病毒作用的代表性物質(zhì)基礎(chǔ)為(R，S)-告依春[2-4]。目前，通過測(cè)定(R，S)-告依春的含量從而對(duì)板藍(lán)根及其制劑進(jìn)行質(zhì)量控制業(yè)已得到廣泛研究和報(bào)道[5-13]。我部連續(xù)4年對(duì)軍隊(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)使用的板藍(lán)根顆粒進(jìn)行評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)，共抽驗(yàn)89個(gè)生產(chǎn)企業(yè)的板藍(lán)根顆粒584批次，基本摸清板藍(lán)根顆粒的質(zhì)量現(xiàn)狀。在評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)基礎(chǔ)上，參考《中華人民共和國藥典》和文獻(xiàn)報(bào)道，建立高效液相色譜(highperformance liquid chromatography，HPLC)法測(cè)定板藍(lán)根顆粒中(R，S)-告依春含量的方法，并測(cè)定其中66個(gè)廠家241批次板藍(lán)根顆粒的(R，S)-告依春含量。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-20AT高效液相色譜儀(帶SPD-M10Avp二極管陣列檢測(cè)器，SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器，日本島津公司)；AUW220D電子分析天平(日本島津公司)；AS-3120A超聲波清洗器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；Synergy-UV超純水器(法國Millipore公司)。

1.2 試藥 (R，S)-告依春對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院提供，批號(hào)：111753-201304，含量測(cè)定以99.9%計(jì)算)；甲醇為色譜純，水為自制超純水，其他試劑均為分析純。板藍(lán)根顆粒來源于66個(gè)廠家共241批次，規(guī)格：每袋10，5和3 g，其中3 g為無蔗糖型。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) SHIMADZU VP-ODS色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-0.02%磷酸溶液(7：93)，流速1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長：245 nm；自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣，進(jìn)樣量10 μL；理論板數(shù)按(R，S)-告依春峰計(jì)應(yīng)不低于5 000。色譜圖見圖1。

A.對(duì)照品溶液；B 供試品溶液；1.(R，S)-告依春

圖1 對(duì)照品溶液和供試品溶液高效液相色譜圖

A.control solution；B.sample solution；1.(R，S)-epigoitrin

Fig.1 HPLC chromatograms of control and sample solution

2.2 供試品溶液和對(duì)照品溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 取裝量差異項(xiàng)下的本品內(nèi)容物適量，混勻，研細(xì)，取約2.0 g(含蔗糖)或1.0 g(無蔗糖)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水20 mL，稱定質(zhì)量，水浴加熱并振搖使溶解，放冷，再稱定質(zhì)量，用水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取(R，S)-告依春對(duì)照品適量，精密稱定，置50 mL量瓶中，加水制成每毫升含150.35 μg的對(duì)照品貯備液。精密吸取對(duì)照品貯備液適量，加水制成不同濃度的對(duì)照品溶液，最終濃度分別為0.058 7，0.234 9，0.939 7，3.758 7，15.035 0，60.139 8，150.349 5 μg·mL-1。

2.3 線性關(guān)系考察 取“2.2.2”項(xiàng)7個(gè)對(duì)照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得(R，S)-告依春的回歸方程為Y=75 672X+6 756(r=0.999 7，n=7)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，(R，S)-告依春在0.058 7～150.349 5 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。設(shè)定液相色譜儀QA/QC參數(shù)，調(diào)整信噪比(S/N)為10：1，得定量限為9.78×10-3μg·mL-1；調(diào)整信噪比(S/N)為3：1，得檢測(cè)限為2.45×10-3μg·mL-1。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一濃度的(R，S)-告依春對(duì)照品溶液(3.758 7 μg·mL-1)，連續(xù)進(jìn)樣6次，(R，S)-告依春峰峰面積的RSD為0.35%，表明精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批檢品(批號(hào)：H2F009)6份，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備，測(cè)得(R，S)-告依春的平均含量為0.052 1 mg·g-1，RSD為0.45%，表明該方法重復(fù)性好。

2.4.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于0，1，2，4，8，16和24 h進(jìn)樣分析，測(cè)得(R，S)-告依春峰峰面積的RSD為1.43%，表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 加樣回收實(shí)驗(yàn) 取已知含量的檢品(廣州白云山和記黃埔中藥有限公司，批號(hào)：H2F009)9份，每份約1.0 g，精密稱定，分別按已知含量的50%，100%和150%加入(R，S)-告依春對(duì)照品，按“2.2.1”項(xiàng)制備，進(jìn)行加樣回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1。

表1 (R，S)-告依春加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.1 Results of recovery tests of(R，S)-eprgoitrin

2.5 樣品含量測(cè)定 按照上述方法，對(duì)其中66家生產(chǎn)企業(yè)的241批次檢品進(jìn)行含量測(cè)定。先按生產(chǎn)企業(yè)，同一企業(yè)再按檢品規(guī)格對(duì)含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，并以平均含量表示其結(jié)果。見表2。

3 討論

選擇測(cè)定波長時(shí)，參照《中華人民共和國藥典》2010 年版一部板藍(lán)根項(xiàng)下規(guī)定，測(cè)定波長為245 nm。同時(shí)，以二極管陣列檢測(cè)器掃描供試品溶液，發(fā)現(xiàn)(245±2)nm處吸收度最大，故選取245 nm作為測(cè)定波長。

選擇流動(dòng)相時(shí)，對(duì)比考察甲醇-0.02%磷酸溶液(7：93)、甲醇-0.5%磷酸溶液(8：92)、乙腈-0.2%二乙胺溶液(10：90)等3種流動(dòng)相，結(jié)果表明，以甲醇-0.02%磷酸溶液(7：93)為流動(dòng)相時(shí)響應(yīng)值好，峰形良好，理論板數(shù)、分離度等符合要求。

本實(shí)驗(yàn)選用不同品牌的色譜柱進(jìn)行比較：SHIMADZU VP-ODS色譜(150 mm×4.6 mm，5 μm)、Agilent ZORBAX Extend C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)、Kromasil KR100-5-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)以及Inertsil ODS3(250 mm×4.6 mm，5 μm)。結(jié)果顯示，4種色譜柱的響應(yīng)均良好，峰形均良好。本實(shí)驗(yàn)僅選擇其中的SHIMADZU VP-ODS(150 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱進(jìn)行方法學(xué)考察和樣品含量測(cè)定。

在提取溶劑的選擇上，(R，S)-告依春為水溶性成分，故直接用水對(duì)樣品進(jìn)行稀釋處理，操作方便，經(jīng)濟(jì)節(jié)省，對(duì)環(huán)境無污染。

由表2可知，抽檢2批次及以上的企業(yè)內(nèi)部各批次的RSD均小于3%，表明各企業(yè)內(nèi)部各批次的(R，S)-告依春含量差異均較小，測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定可靠。各生產(chǎn)企業(yè)之間的平均含量差異則較大：最高者為每袋2.879 6 mg，最低者則為未檢出(測(cè)定值低于定量限，判為未檢出)。各生產(chǎn)企業(yè)檢品的含量差異如此之大，可能與選用的板藍(lán)根飲片原料來源不同以及制備工藝差異有關(guān)。

目前，尚未有文獻(xiàn)報(bào)道板藍(lán)根顆粒中(R，S)-告依春的含量限度。《中華人民共和國藥典》2010年版一部“板藍(lán)根”項(xiàng)下規(guī)定，飲片含(R，S)-告依春不得少于0.030%。板藍(lán)根顆粒有4種規(guī)格，其中每袋10 g相當(dāng)于飲片14 g，每袋5，3，1 g均相當(dāng)于飲片7 g。按轉(zhuǎn)移率100%計(jì)算，可得10 g的限度為4.2 mg，其他規(guī)格限度為2.1 mg。但以上僅為理論折算，實(shí)驗(yàn)測(cè)得檢品中的含量遠(yuǎn)低于此。10 g和5 g規(guī)格為含糖型顆粒，而3 g規(guī)格為無糖型顆粒，測(cè)定結(jié)果未發(fā)現(xiàn)3種規(guī)格的含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這說明顆粒劑中有無蔗糖對(duì)含量測(cè)定結(jié)果無顯著性影響。

本次抽驗(yàn)中，10 g規(guī)格的檢品有201批次，經(jīng)計(jì)算，(R，S)-告依春每袋平均含量為0.466 0 mg。假定以平均含量的20%為限度參考值，其數(shù)值為0.093 2 mg，取整為0.10 mg。參照此限度值，10 g規(guī)格的檢品中，有50個(gè)廠家共186批次的樣品合格，合格率為92.54%。根據(jù)處方，取規(guī)格5，3和1 g含量限度值為10 g的一半，為每袋0.050 mg，即每袋50 μg，以此為限度，本次測(cè)定的該2種規(guī)格的檢品全部合格。上述限度值僅是根據(jù)此次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行的人為假定，其合理性仍有待于進(jìn)一步的研究確認(rèn)。

制定有效成分含量限度要考慮到制備提取工藝、轉(zhuǎn)移率等多種因素的影響[14-17]，其中藥效學(xué)和藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)是重要的參考依據(jù)。文獻(xiàn)報(bào)道，基于流感病毒神經(jīng)氨酸酶(neuramidinase，NA)抑制活性評(píng)價(jià)的(R，S)-告依春抗病毒作用的最低有效含量點(diǎn)為82.5 μg·mL-1[18]。假定最低有效含量即最低血藥濃度，取表觀分布容積為4.3 L，體質(zhì)量為60 kg，不考慮藥動(dòng)學(xué)等因素，則一日最低有效劑量為82.5×4.3×1 000/(1 000×60)=5.912 5 mg·kg-1。用量按每次2袋，每天4次計(jì)算，則每袋最低含量應(yīng)為5.912 5×60/8=44.34 mg，即每袋板藍(lán)根顆粒中(R，S)-告依春的最低含量應(yīng)為44.34 mg。以此為限度，本次測(cè)定的檢品全部不合格。誠然，上述的計(jì)算是否合理，需要更詳實(shí)的藥效學(xué)和藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)的支持，但以上計(jì)算表明，板藍(lán)根的抗病毒作用應(yīng)為多種成分共同作用的結(jié)果，而不僅僅是(R，S)-告依春起作用。基于抗病毒活性檢測(cè)的板藍(lán)根質(zhì)量生物平均方法證實(shí)這一點(diǎn)[19-21]。研究表明，板藍(lán)根對(duì)NA的抑制活性IC50=(0.90±0.20) mg·mL-1(生藥)，相對(duì)于(R，S)-告依春的最低有效濃度(82.5 μg·mL-1)，其比值約為1：11，遠(yuǎn)大于板藍(lán)根中(R，S)-告依春的百分含量值(最低為0.030%)。這表明，板藍(lán)根顆粒中其他成分的存在對(duì)(R，S)-告依春的抗病毒作用的發(fā)揮產(chǎn)生影響，只是這些成分在其中所起的作用與藥效作用的關(guān)聯(lián)度不同，從而共同發(fā)揮抗病毒作用。因此，對(duì)于(R，S)-告依春的含量限度，仍需要進(jìn)一步的藥效學(xué)、藥動(dòng)學(xué)以及臨床實(shí)驗(yàn)等數(shù)據(jù)資料的支持。

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DOI 10.3870/yydb.2015.06.024

Determination of (R,S)- Epigoitrin inBanlangenGranules by HPLC

GONG Wei, LIU Zhongliang, ZHAO Qinghua, WEN Fenge, LI Peng,ZHANG Kun, ZHAO Mei

(InstituteforDrugandInstrumentControl,JointLogisticsDepartmentofJinanMilitaryCommand,Ji’nan250022,China)

Objective To establish HPLC method for determination of (R,S)-epigoitrin inBanlangengranules and discuss the content limitation. Methods The samples were separated on SHIMADZU VP-ODS (150 mm×4.6 mm, 5 μm) and the mobile phase consisted of methol-0.02% phosphoric acid solution (7：93) at a flow rate of 1.0 mL.min-1.The detection wavelength was set at 245 nm and the injection volume (in automatic sampler) was 10 μL.The content limitation was assessed according to the transfer rate and statistical data of the results. Results (R,S)-epigoitrin showed a good linear relationship at concentration of 0.058 7-150.349 5 μg·mL-1(r=0.999 7,n=7).The average recovery rate was 98.72%, 98.40% and 98.60%, respectively； RSD was 1.84%, 0.50% and 1.82%, respectively.The content limitation of (R,S)-epigoitrin was unreasonable according to the transfer rate and the statistical data of the results. Conclusion The method is easy and simple to operate, accurate and stable in results, and highly specific, thus it is applicable for the quality control of Banlangen granules.The content limitation should be determined on the basis of pharmacokinetic and pharmacodynamic data.

Banlangen Granules； (R,S)-epigoitrin；Content limitation； Chromatography,high performance liquid

2014-03-04

2014-07-17

*濟(jì)南軍區(qū)后勤科研計(jì)劃項(xiàng)目(CJN12L078)

鞏偉(1980-)，男，山東新泰人，主管藥師，博士，研究方向：藥品質(zhì)量分析。電話：0531-51637775，E-mail：gongweicn@foxmail.com。

R927.2；R284.1

B

1004-0781(2015)06-0791-05