殼聚糖凝膠對醋酸誘導大鼠直腸損傷的影響*

黎小平，黃宗海，胡立春，樓彩霞

(1.南方醫科大學附屬珠江醫院普外科，廣州 510280；2.廣東省佛山市南海區第三人民醫院普外科，佛山 528244；3.廣東省醫學實驗動物中心，佛山 528248)

殼聚糖凝膠對醋酸誘導大鼠直腸損傷的影響*

黎小平1，2，黃宗海1，胡立春2，樓彩霞3

(1.南方醫科大學附屬珠江醫院普外科，廣州 510280；2.廣東省佛山市南海區第三人民醫院普外科，佛山 528244；3.廣東省醫學實驗動物中心，佛山 528248)

目的 檢測殼聚糖凝膠對醋酸誘導的大鼠直腸損傷的影響。方法 將大鼠麻醉，以4%醋酸棉簽經大鼠肛門置入直腸1 min，深度3 cm，制備大鼠直腸損傷模型36只，隨機分為模型對照組、陽性對照組和藥物組，每組12只。藥物組經肛門給予殼聚糖凝膠 1 575 mg·kg-1，陽性對照組給予痔瘡膏1 575 mg·kg-1，連續6 d，給藥后30 min，1，4，6 d，各組分別處死大鼠3只，解剖大鼠，肉眼觀察大鼠直腸損傷情況，觀察各組之間在給藥各時間段的直腸病理學形態差異。結果 給藥組用藥30 min，1，4，6 d后，大鼠直腸黏膜損傷計分較模型對照組和陽性對照組低，上皮組織壞死、間質充血、出血、水腫、腺體破壞、炎癥細胞浸潤等病理現象明顯較模型對照組和陽性對照組輕，修復速度較模型對照組和陽性對照組快，并且沒有較明顯的瘢痕出現。結論 殼聚糖凝膠可明顯減輕4%醋酸造成的直腸損傷，具有一定的治療作用。

殼聚糖凝膠；損傷，直腸；醋酸

痔是常見病和多發病，可伴有出血、脫垂等癥狀。近年來痔的保守治療取得很大的進步，但痔的切除率下降及肛墊保存術的興起并非意味著傳統的痔切除手術不重要，特別對于痔已發展為Ⅲ度、Ⅳ度，無論是病理解剖，還是生理功能已不再具有可逆性的時候，手術治療尤顯得重要[1]。它仍然是目前療效確切的常用方法。臨床上應用最多的仍是傳統的外剝內扎術。然而疼痛、出血、感染、肛周水腫及創面延遲愈合等是痔手術后的常見并發癥，長期困擾廣大醫務人員。殼聚糖是一種天然高分子聚合物，生物相容性好，毒性低，可生物降解，具有抗菌、止血和成膜作用，廣泛應用于生物工程等領域，但目前在痔瘡領域應用甚少。筆者在本實驗通過探討殼聚糖凝膠對醋酸誘導直腸損傷模型的作用[2]，旨在尋找一種藥物減少或減輕術后并發癥。

1 材料與方法

1.1 動物 無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級斯潑累格·多雷(Sprague Dawley,SD)大鼠36只，合格證號：44007200003906，雄性，體質量：180～220 g；由廣東省醫學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號：SCXK(粵)2013-0002，動物使用許可證號：SYXK(粵)2008-0002。動物飼養在廣東省醫學實驗動物中心SPF級動物房，動物飼養條件：每只大箱飼養6只，飼養溫度20～26 ℃，相對濕度：40%～70%，采用10 h：14 h晝夜間斷照明；飼養室條件始終保持穩定，以保證實驗結果的可靠性。大鼠自由進食飲水，顆粒飼料和飲用水均由廣東省醫學實驗動物中心提供。

1.2 試藥 4%醋酸(廣州中南化學試劑有限公司，批號：130113，配制方法：準確量取醋酸1 mL，加入到純化水24 mL中，混勻。殼聚糖凝膠(沈陽博大精益生物制藥有限公司，批號：130802，規格：每支3 g)。陽性對照痔瘡膏(規格：每支2.5 g)。

1.3 儀器 TS-12N全自動生物組織脫水機(孝感宏業醫用儀器有限公司)；BM-VⅡ生物組織包埋機(孝感宏業醫用儀器有限公司)；RM2135石蠟切片機(德國Leica公司)；CS-VⅠ攤片烤片機(孝感宏業醫用儀器有限公司)；RS-18Ⅱ生物組織自動染色機(孝感宏業醫用儀器有限公司)；BX41病理圖像分析系統(日本奧林巴斯)。

1.4 動物模型的建立 用飽和苦味酸對大鼠進行編號，在大鼠體表不同部位的被毛涂染斑點，以示不同號碼。以大鼠皮膚染色和籠具雙重編號標記識別。對購入大鼠檢疫3 d。期間每日檢查大鼠一次，未發現不健康的動物，全部納入實驗。造模前，大鼠禁食1 d，將大鼠麻醉，以4%醋酸棉簽經大鼠肛門置入直腸1 min，深度3 cm，制備大鼠直腸損傷模型36只。

1.5 大鼠分組和給藥方法 從實驗開始至實驗結束每天觀察動物1次。實驗開始測量體質量1次。將36只大鼠隨機分為3組：模型對照組、藥物組和陽性對照組每組12只。大鼠給藥前，予以麻醉。藥物組在直腸損傷后30 min～6 d，經肛門給予殼聚糖凝膠，置入深度為3 cm，給藥劑量為1 575 mg·kg-1[按人的給藥劑量(50 mg·kg-1·d-1)換算，使用大鼠等效劑量的5倍]，每日1次，給藥后按壓大鼠直腸使凝膠融化并分布均勻；陽性對照組給予痔瘡膏，置入深度為3 cm，給藥劑量為1 575 mg·kg-1，每日1次，給藥后按壓大鼠直腸使藥物分布均勻。模型對照組給予同樣的按壓，但不給藥物。

1.6 損傷計分 給藥后30 min和1，4，6 d各個時間段，各組分別麻醉處死大鼠3只(共12只)，解剖大鼠，肉眼觀察大鼠直腸損傷情況，參照文獻[2]黏膜損傷計分方法，記錄黏膜損傷分數：點線狀出血、小紅斑(<1 mm)計為1分；片狀出血、大紅斑(≥1 mm)計為3分；糜爛和潰瘍計為5分。

1.7 病理形態觀察 所有直腸標本常規脫水、包埋、切片、蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色，光鏡觀察并攝像，觀察各組之間、給藥各時間段的直腸病理學形態差異。

2 結果

2.1 損傷計分 藥物組給予殼聚糖凝膠30 min，1，4，6 d后，大鼠直腸黏膜損傷計分較模型對照組和陽性對照組低。見表1。

2.2 給藥30 min病理結果 模型對照組直腸損傷30 min時，腸黏膜下出血、水腫和糜爛，鏡下見黏膜上皮組織壞死，部分腺體留存，黏膜下層水腫，間質血管擴張充血。陽性對照組直腸損傷有所減輕，鏡下見黏膜上皮組織壞死，部分腺體留存，黏膜下層水腫，間質血管擴張充血；藥物組損傷稍減輕，鏡下見黏膜上皮組織壞死，部分腺體留存，局部黏膜層出血，黏膜下層水腫，間質血管擴張充血。見圖1。

2.3 給藥1 d病理結果 模型對照組直腸損傷1 d時，腸黏膜下出血、水腫和糜爛，鏡下見黏膜層全層壞死伴出血，未見腺體留存，黏膜下層水腫、充血、局部出血、間質炎細胞浸潤。陽性對照組直腸損傷減輕，鏡下見黏膜層全層壞死、出血，黏膜下層水腫、充血、炎細胞浸潤。藥物組直腸損傷明顯減輕，鏡下見部分黏膜層壞死、出血，黏膜下層水腫、充血、出血、炎細胞浸潤。見圖2。

表1 3組大鼠給藥不同時間直腸黏膜損傷計分

與模型對照組比較，*1P<0.05；與陽性對照組比較，*2P<0.05

Compared with model control group，*1P<0.05；compared with positive control group，*2P<0.05

圖1 3組大鼠直腸損傷造模給藥30 min直腸黏膜損傷和病理圖片(HE，×200)

A.model control group；B.positive control group；C.drug group)

Fig.1 Mucosal injury of rectum and its pathology of three groups of rats 30 min after modeling of rectal injury(HE，×200)

圖2 3組大鼠直腸損傷造模給藥1 d直腸黏膜損傷和病理圖片(HE，×200)

A.model control group；B.positive control group；C.drug group

Fig.2 Mucosal injury of rectum and its pathology of three groups of rats one day after modeling of rectal injury(HE，×200)

2.4 給藥4 d病理結果 模型對照組直腸損傷4 d時，腸黏膜下出血、水腫和糜爛減輕，鏡下見上皮及腺體損傷依然嚴重，大量黏膜層全層壞死，黏膜下層大量肉芽組織增生、炎細胞浸潤。陽性對照組直腸損傷稍減輕，鏡下見上皮及腺體損傷稍減輕，黏膜上皮覆蓋不明顯，局部少量黏膜上皮組織脫落。藥物組直腸損傷明顯減輕，鏡下見黏膜上皮覆蓋明顯，局部少量黏膜上皮組織脫落。見圖3。

2.5 給藥6 d病理結果 模型對照組直腸損傷6 d時，腸黏膜下出血、水腫和糜爛減輕，鏡下見上皮及腺體損傷依然嚴重，部分黏膜上皮組織全層壞死，黏膜下層大量肉芽組織增生、炎細胞浸潤。陽性對照組直腸損傷大部分痊愈，鏡下見黏膜上皮大部分組織完整，只見少量的壞死、充血、出血、水腫、炎癥細胞浸潤等病理變化。藥物組直腸損傷基本痊愈，鏡下見黏膜上皮組織完整，未見明顯的壞死、充血、出血、水腫、炎癥細胞浸潤等病理變化。同時取正常大鼠(正常對照組)，處理后取腸黏膜觀察，并作病理切片，各組進行比較。見圖4。

圖3 3組大鼠直腸損傷造模給藥4 d直腸黏膜損傷和病理圖片(HE，×200)

A.model control group；B.positive control group；C.drug group

Fig.3 Mucosal injury of rectum and its pathology of three groups of rats four days after modeling of rectal injury(HE，×200)

3 討論

殼聚糖是一種天然高分子聚合物，屬于氨基多糖，學名：(1.4)-2-乙酰胺基-2-脫氧-β-D-葡萄糖。它是少見的帶正電荷的高分子化合物，是至今為止發現的唯一帶陽離子電荷的堿性多糖[3]，殼聚糖在自然界中廣泛存在于低等生物菌類、藻類的細胞和節肢動物蝦、蟹、昆蟲等的外殼中。

殼聚糖凝膠(Ⅲ型)是以殼聚糖為主要材料，是一種生物可降解性高分子多糖類生物材料，為芳香、半透明的凝膠，不溶于水，動力黏度不低于1 000 mPa·s-1，pH 為4.0～7.0，生物相容性好，毒性低，可生物降解。

殼聚糖對多種細菌的生長具有抑制作用，是抗菌譜較廣的天然抗菌物質，對革蘭陽性菌、革蘭陰性菌及真菌，均有明顯抑制效果[4-6]。其抑菌機制的最新研究表明：殼聚糖并不是通過干擾細胞質的正常分布而產生作用，而是首先引起細菌細胞內酶外泄與細菌細胞壁的損壞影響細胞壁的正常功能，使從而導致菌體的死亡。

殼聚糖有良好的止血效果，雖然目前對于殼聚糖的止血機制尚未完全了解，但可以肯定的是其與常規的依賴血小板和凝血因子的瀑布機制不同。殼聚糖的止血機制隨著研究的深入，越來越多的學者認為其止血作用不僅與血小板聚集有關，更與紅細胞聚集有關，紅細胞膜的負電荷與殼聚糖的正電荷基團間的離子作用力是殼聚糖止血活性的一個可能的原因。

另外殼聚糖有明顯的膜形成作用，2 min 內可以在傷口自然成一層膜，將直腸內惡劣的環境有效隔離，這樣可以保護創面，明顯減輕創面的疼痛。

近年來，在食品、藥品、保健、生物醫藥領域的應用日益引起人們的高度重視[7]，但其在痔術后的應用臨床效果國內外報道目前較少見。

通過本實驗，可看出殼聚糖凝膠可明顯減輕4%醋酸造成的直腸損傷，具有一定的治療作用。但殼聚糖凝膠在臨床上的應用及效果還有待于進一步的臨床實驗研究。

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DOI 10.3870/yydb.2015.06.008

Effect of Chitosan Gel on the Rectum Injury Induced by Acetic Acid in Rats

LI Xiaoping1,2,HUANG Zonghai1,HU Lichun2,LOU Caixia3

(1.DepartmentofGeneralSurgery,ZhujiangHospitalAffiliatedtoSouthernMedicalUniversity,Guangzhou510280,China；2.DepartmentofGeneralSurgery,theThirdPeople’sHospitalofNanhaiDistrict,FoshanCity,GuangdongProvince,Foshan528244,China；3.MedicalAnimalExperimentCenterofGuangdongProvince,Foshan528248,China)

Objective To detect the effect of chitosan gel on rectal injury which was induced by acetic acid. Methods 36 rats were anesthetized, 4% acetic acid swab was placed into the rectum (3 cm in depth for 1 min) to establish rectum injury model.These rats were divided into model control group, positive control group and drug group with 12 rats each group randomly.Chitosan gel was given to the drug group through anus with the dose of 1 575 mg·kg-1, and hemorrhoid cream (1 575 mg·kg-1) was administered in the positive control group for 6 successive days.At 30 min, 1, 4, 6 day(s) after administration, 3 rats of each group were sacrificed， and were dissected, rectal injury and rectal pathology morphology changing of each group at different time points of administration were compared through visual observation. Results At 30 min, 1, 4, and 6 day(s) after administrating chitosan gel, score of rectum mucosa injury in dury group was lower than those in model control and positive control group.Pathological changes (including epithelial tissue necrosis, mesenchyme hyperemia, hemorrhage, edema, gland injury, infiltration of inflammatory cells) were significantly slighter in drug group than in model control group and positive control group.Those lesions were restored faster in drug group than in model control group and positive control group, and there was no obvious scar. Conclusion Chitosan gel can obviously alleviate the rectal injury caused by 4% acetic acid and has therapeutic effect.

Chitosan gel；Injury, rectum； Acetic acid

2014-04-02

2014-07-31

*佛山市醫學類科技攻關項目(201308149)

黎小平(1975-)，男，江西南城人，副主任醫師，在讀博士，研究方向：痔瘡治療的進展。電話：(0)18124804355，E-mail：pingli1975@sina.com。

R965；R657.1

A

1004-0781(2015)06-0733-04