紫杉醇長循環熱敏脂質體對Lewis肺癌移植瘤的抑制作用*

李美波，顧生玖，趙文鵬，朱開梅

(桂林醫學院藥學院，桂林 541004)

紫杉醇長循環熱敏脂質體對Lewis肺癌移植瘤的抑制作用*

李美波，顧生玖，趙文鵬，朱開梅

(桂林醫學院藥學院，桂林 541004)

目的 研究紫杉醇長循環熱敏脂質體(PLTL)對Lewis肺癌移植瘤的抑制作用。方法 建立小鼠Lewis肺癌模型，將40只荷瘤鼠隨機分為5組，空白對照組、模型對照組、紫杉醇注射液(PTX)組、紫杉醇熱敏脂質體(PTL)組和PLTL組，每組8只。空白對照組和模型對照組注射0.9%氯化鈉溶液，PTX組、PTL組和PLTL組，每只小鼠給藥總劑量為紫杉醇20 mg·kg-1，采用0.9%氯化鈉溶液稀釋，每次注射0.2 mL。除空白對照組外，其他組給藥后5 min內立即將小鼠的腫瘤部位固定于(42±0.5)℃的恒溫水浴中加熱30 min。治療期間觀察移植瘤體生長情況，蘇木精-伊紅(HE)染色檢測腫瘤組織的病理學形態改變，觀察腫瘤細胞的形態學變化，采用流式細胞術檢測腫瘤細胞的凋亡率，考察PLTL聯合局部熱療對小鼠腫瘤的抑瘤作用。結果 模型對照組、PTX組、PTL組和PLTL組抑瘤率分別為21.81%，48.87%，57.22%和78.87%，腫瘤細胞凋亡率分別為(20.4±4.2)%，(42.7±3.8)%，(54.6±2.9)%和(69.7±5.0)%，腫瘤組織切片HE染色發現，PLTL組腫瘤細胞凋亡與壞死數量明顯增多。結論 PLTL與PTX，PTL比較，具有明顯的熱敏靶向性，與局部熱療相結合顯著提高紫杉醇的治療效果。

紫杉醇；脂質體，熱敏，長循環；癌，肺

據世界衛生組織統計，全球范圍內，肺癌的發病率與病死率均居第一位[1]，因此肺癌仍然是全世界面臨的公共健康問題。《2012中國腫瘤登記年報》顯示[2]，我國肺癌病死率居惡性腫瘤首位。紫杉醇(paclitaxel，PTX)是從紅豆杉屬植物中分離得到的一種抗腫瘤藥物，其對卵巢癌、乳腺癌、非小細胞肺癌、肝癌[3]等多種腫瘤有良好的治療效果[2]，現已成為多種惡性腫瘤治療的首選藥。然而，由于紫杉醇不溶于水及多種藥用溶媒，目前市售紫杉醇注射液均采用由聚氧乙基蓖麻油和無水乙醇組成的混合溶媒，而聚氧乙基蓖麻油對人體具有多種毒性并引發部分患者嚴重變態反應，因而使紫杉醇注射液的應用受到限制。脂質體是一種新型藥物載體，它具有改善藥物溶解性，延長藥物半衰期，提高藥物靶向性和降低藥物毒副作用等優點[4]。為解決紫杉醇的溶解性和毒副作用問題，提高藥物作用療效，筆者將紫杉醇制備成長循環熱敏脂質體，并將其作用于Lewis肺癌荷瘤小鼠，評價其體內的抗癌療效。

1 材料與方法

1.1 動物 無特定病原體(specific pothogen free,SPF)級C57BL/6小鼠40只，雌性，體質量(19±2)g，由桂林醫學院實驗動物中心提供。動物生產許可證號：SCXK(桂)2013-0001號。動物自由飲水、進食。

1.2 細胞株 Lewis肺癌細胞株購自于中國科學院典型培養物保藏中心昆明細胞庫。

1.3 試劑與儀器 紫杉醇(桂林暉昂生化藥業公司，批號：JF20100304)；紫杉醇注射液(揚子江藥業集團有限公司，批號：13012111)；紫杉醇長循環熱敏脂質體(PLTL，由本實驗室采用薄膜分散法制備，包封率約95%，粒徑分布在80～133 nm)；紫杉醇熱敏脂質體(PTL，由本實驗室采用薄膜分散-過膜法制備，包封率約97%，粒徑分布在84～127 nm)；胎牛血清(Hyclone，批號：NXA0544)；達爾伯克改良伊格爾培養液(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM，Hyclone，批號：NYG0923)；Annexin V 凋亡試劑盒(eBioscience，批號：E09656-1649)；二氧化碳培養箱(美國Thermo公司)；FCM(Becton Dickinson，美國)；電子數顯卡尺(北京量具刃具廠)；光學顯微鏡(日本OLYMPUS BX51)。

1.4 小鼠Lewis肺癌細胞株的培養 Lewis肺癌細胞株培養于含10%小牛血清的DMEM培養液中，37 ℃、5%二氧化碳孵箱中培養，細胞半貼壁生長，每2 d換培養液1次，3～4 d傳代1次。

1.5 Lewis肺癌荷瘤腫瘤模型的建立 取對數生長期Lewis細胞，用0.25%胰酶溶液消化，用不含血清的培養液吹打細胞制成細胞懸液，并調整細胞濃度為1×107個·mL-1，于小鼠右后肢靠背部皮下注射細胞懸液，每只接種0.2 mL。

1.6 小鼠分組和給藥方法與體內抑瘤實驗 待小鼠腫瘤直徑達到8 mm時(記為第0天)，選取瘤體積一致的荷瘤小鼠隨機分為5組，每組8只，分別為空白對照組(注射0.9%氯化鈉溶液)、模型對照組(注射0.9%氯化鈉溶液+加熱)、PTX組(注射紫杉醇注射液+加熱)、PTL組(注射PTL+加熱)和PLTL組(注射PLTL+加熱)，給藥總劑量20 mg·kg-1。給藥前各組小鼠均腹腔注射戊巴比妥鈉溶液麻醉，然后尾靜脈注射給藥，給藥后5 min內，除空白對照組外，其他組立即將小鼠腫瘤部位固定于42 ℃水浴中加熱20 min，每隔2 d治療1次，共治療3次。治療期間每天觀察小鼠生存狀態、測量腫瘤的長短徑，計算腫瘤的體積(V)，V=1/2長徑×短徑2(單位：mm3)，繪制腫瘤生長曲線。并于第9天處死小鼠，剝取腫瘤組織稱定質量，計算抑瘤率，抑瘤率(%)=(1-治療組瘤質量/空白對照組瘤質量)×100%。

1.7 腫瘤組織蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色 第9天處死動物，取一部分新鮮的腫瘤組織，用4%多聚甲醛溶液固定，組織脫水，蠟塊包埋，病理切片，經梯度乙醇脫蠟、染色、中性樹膠封固，顯微鏡觀察并采集圖像。

1.8 組織流式細胞儀分析腫瘤細胞凋亡 第9天處死動物后取新鮮腫瘤組織，研磨，濾過，冷磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)1 000 r·min-1離心5 min，收集細胞，棄上清液，冷PBS洗滌細胞2次(1 000 r·min-1，5 min)。1×結合緩沖液懸浮細胞(1×106個·mL-1)，加入AnnexinV-FITC 5 μL，輕輕混勻后于2～8 ℃避光條件下孵育20 min，然后加入碘化丙啶(propidium iodide，PI)5 μL后輕輕混勻，于2～8 ℃避光條件下孵育5 min，1 h內流式細胞儀檢測，進行細胞凋亡率分析。

2 結果

2.1 小鼠生存狀態、腫瘤體積生長曲線以及抑瘤率結果 在小鼠尾源靜脈給藥的過程中，PLTL組和PTL組小鼠與注射0.9%氯化鈉溶液小鼠一樣，無不良反應，PTX組的小鼠出現精神狀態差、萎靡不振、毛色晦暗、飲食活動明顯減少、易激惹躁動等癥狀，且該組動物在給藥后3～4 d內出現食欲不振及體質量減輕等不良反應。說明紫杉醇納米脂質體劑型能明顯降低紫杉醇毒副作用。各組小鼠的腫瘤生長曲線(圖1)，經3次治療后，除空白對照組外，其余各組腫瘤生長均受到不同程度抑制，PTX組腫瘤體積幾乎保持不變，而PTL組及PLTL組腫瘤體積開始緩慢下降，與空白對照組比較，其他4組均顯示腫瘤的生長受到抑制，但PLTL組抑瘤效果最佳。各組小鼠腫瘤體積、瘤質量及抑瘤率見表1，模型對照組、PTX組、PTL組和PLTL組均有較明顯的抑瘤作用。PTL組的抑瘤率高于PTX組，但差異無統計學意義，而PLTL組抑瘤率明顯高于其余4組，差異有統計學意義，可見PLTL結合熱療可顯著提高紫杉醇抗腫瘤效果。

2.2 腫瘤組織形態學 結果見圖2。5組腫瘤細胞保留腫瘤細胞特有的異型性，核大深染，核異型，核細胞質比例高；模型對照組及其他給物組圖中見凋亡細胞，表現為核染色質致密濃縮，核碎裂，凋亡小體形成；凋亡細胞周圍可見淋巴細胞及單核巨噬細胞，數量表現為模型對照組、PTX組、PTL組及PLTL組依次增多，各組腫瘤均出現不同程度的細胞壞死現象，其中PLTL組腫瘤細胞廣泛壞死，核碎裂溶解，細胞結構消失(圖2E)，而PTL組可見部分腫瘤細胞核碎裂、固縮，細胞結構消失以及片狀壞死灶(圖2D)，PTX組可見灶性壞死灶(圖2C)。

與空白對照組比較，*1P<0.05；與模型對照組比較，*2P<0.05；與PTX組比較，*3P<0.05；與PTL組比較，*4P<0.05

Compared with blank control group，*1P<0.05；compared with model control group，*2P<0.05；compared with PTX group，*3P<0.05；compared with PTL group，*4P<0.05

2.3 細胞凋亡結果 應用FCM術對活體腫瘤組織進行細胞凋亡的檢測，腫瘤細胞凋亡結果(圖3)。空白對照組、模型對照組、PTX組、PTL組及PLTL組細胞凋亡率分別為(9.4±2.0)%，(20.4±4.2)%，(42.7±3.8)%，(54.6±2.9)%和(69.7±5.0)%，與空白對照組比較，均差異有統計學意義(F=732.793，P=0.000)，PTL組和PLTL組與PTX組比較也差異有統計學意義(P=0.000)，PTL組和PLTL組比較差異有統計學意義(P=0.000)，該結果同以上腫瘤質量和抑瘤率的結果一致。

3 討論

熱療是腫瘤治療中一種輔助療法，主要是利用腫瘤細胞對高溫較敏感，通過對機體局部加溫而達到殺死腫瘤細胞的目的，腫瘤組織局部加熱39～42 ℃可使腫瘤組織血管閉塞和出血[5]，因此局部區域高熱也是一個有用的輔助治療，可增加藥物的運輸和靶向藥物的蓄積。本實驗中模型對照組與空白對照組相比均表現出較好的抑瘤效果，腫瘤質量抑瘤率為21.8%，流式檢測凋亡細胞結果為(20.4±4.2)%，與空白對照組比較，均差異有統計學意義，HE切片也顯示凋亡細胞與點狀壞死灶增多。

熱敏脂質體聯合局部熱療可明顯增強化療藥的抗腫瘤療效[6]，本研究也證實紫杉醇熱敏脂質體聯合局部熱療可增加靶向性，增強抗癌療效，實驗中PTL組抗腫瘤效果優于PTX組。長循環熱敏脂質體不僅具有熱敏特性，還可延長在體內循環時間，達到長循環的目的[7]。本實驗證實紫杉醇長循環熱敏脂質體聯合局部熱療能明顯抑制Lewis肺癌荷瘤鼠移植瘤的生長。PLTL組的腫瘤質量抑瘤率和腫瘤細胞凋亡率均明顯高于PTL組，且差異有統計學意義，充分體現長循環特性，主要因為PEG修飾脂質體降低了RES對藥物的吞噬，降低脂質體的血液清除率，延長PLTL在血液中的循環時間，增加藥物與腫瘤組織的接觸機會[8]。

化學治療藥物毒副作用較大，本次實驗中PTX組小鼠治療后出現精神萎靡、毛色暗淡等癥狀，PTX組和PTL組體質量下降也較PLTL組明顯，可見PLTL的毒副作用相對較低。

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DOI 10.3870/yydb.2015.06.006

Inhibitory Effect of Paclitaxel Long-circulating Thermo-sensitive Liposome on Lewis Lung Cancer Cells in Mice

LI Meibo, GU Shengjiu, ZHAO Wenpeng, ZHU Kaimei

(SchoolofPharmacy,GuilinMedicalUniversity,Guilin541004,China)

Objective To observe the effect of paclitaxel long-circulating thermo-sensitive liposome (PLTL) on inhibiting the growth of transplanting Lewis lung cancer cells in C57BL/6 mice. Methods The model of mice carried Lewis lung cancer was established.40 tumor-bearing mice were divided into five groups randomly: blank control group, model control group, PTX group, PTL group and PLTL group, 8 mice for each group.The blank control group and the model control group were injected with 0.9% sodium chloride solution.In PTX group, PTL group and PLTL group, the dose of per injection was calculated with the reference of PTX for 20 mg·kg-1, diluted with 0.9% sodium chloride solution, and the mice were injected via the tail vein with a volume of 0.2 mL each time.Except for the blank control group, 5 minutes after administration, the tumors of the other groups were subjected to local hyperthermia at (42±0.5) ℃ for 30 min.During the treatment period, transplantation tumor growth was observed； pathological morphology changes of tumor tissues and cells were detected by HE stain； apoptosis rate of tumor cells was determined by flow cytometry to investigate the inhibition effect of PLTL combined with local thermal therapy on the tumor. Results The inhibition rate of tumor in model control group, PTX group, PTL group and PLTL group was 21.81%, 48.87%, 57.22% and 78.87%, respectively.The apoptosis rate of tumor cells was (20.4±4.2)%, (42.7±3.8)%, (54.6±2.9)% and (69.7±5.0)%, respectively.Observed by pathology, apoptosis rate and necrosis number of tumor cells in PLTL group were significantly increased. Conclusion Compared with PTX and PTL, PLTL has an evident thermo-sensitive feature and can increase the anticancer effect of paclitaxel remarkably when combined with local hyperthermia.

Paclitaxel； Liposome, thermo-sensitive, long-circulating；Cancer, lung

2014-02-10

2014-04-18

*廣西科技攻關項目(桂科能129825-21，桂科合14123001-22)；廣西教育廳項目(201202ZD065，2013YB154)；桂林市科技攻關項目(20140105-11，20140122-5，20140105-5，20140105-6，20130103-8，20130103-9，20130113-1，2013lX080)

李美波(1985-)，女，湖北襄陽人，碩士，從事藥物抗腫瘤基礎研究。電話：(0)13557739982，E-mail：gllimb@163.com。

朱開梅(1967-)，女，廣西桂林人，教授，碩士，主要從事化學致病分子機制和藥物防治研究。電話：(0)18978345717，E-mail：glzkm@163.com。

R979.1；R965；R734.2

A

1004-0781(2015)06-0726-04