香加皮杠柳苷對肺癌A549細胞凋亡及Survivin表達的影響*

張靜，張超，楊光，單保恩，劉江惠

(河北醫科大學第四醫院1.康復科；2.科研中心；3.放射科，石家莊 050011)

·藥物研究·

香加皮杠柳苷對肺癌A549細胞凋亡及Survivin表達的影響*

張靜1，張超2，楊光3，單保恩2，劉江惠2

(河北醫科大學第四醫院1.康復科；2.科研中心；3.放射科，石家莊 050011)

目的 研究香加皮杠柳苷(CPP)對人肺癌A549細胞凋亡及survivin表達的影響，探討其抗腫瘤作用及作用機制。方法 采用噻唑藍(MTT)法檢測1.25，2.50，5.00，10.00，20.00 ng·mL-1CPP處理24，48，72 h對人肺癌A549細胞的抑制作用；應用流式細胞術分析不同濃度CPP(2.50，5.00，10.00 ng·mL-1)分別作用于A549細胞6，12，24，48，72 h對細胞凋亡和凋亡率的影響；應用吖啶橙/溴乙啶(AO/EB)熒光染色法和透射電鏡觀察CPP處理前后A549細胞凋亡的形態學及超微結構變化；采用反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)法檢測CPP作用后A549細胞中凋亡抑制基因survivin的mRNA表達情況；應用Western blot檢測CPP對A549細胞survivin蛋白表達的影響。結果 CPP能顯著抑制人肺癌A549細胞的生長，最大抑制率(93.46±2.35)%。流式細胞術結果顯示，CPP處理組可見典型的凋亡峰，與對照組比較，A549細胞的凋亡率明顯升高(P<0.05)。熒光顯微鏡下可見CPP處理組A549細胞呈橘紅色的凋亡細胞形態。透射電鏡下可見經CPP處理的A549細胞體積變小，出現細胞質凝縮，核內染色質凝聚邊集于核膜，內質網擴張，細胞質空泡化等凋亡細胞的特征性超微結構改變。RT-PCR結果顯示，經CPP處理的A549細胞中survivin mRNA表達降低(P<0.05)，10.0 ng·mL-1CPP組survivin mRNA表達由對照組的(0.928±0.016)降至(0.251±0.012)；Western blot結果顯示CPP組細胞中survivin蛋白表達明顯減弱。結論 CPP可誘導人肺癌A549細胞發生凋亡，可通過下調survivin基因的mRNA和蛋白表達而發揮誘導細胞凋亡作用。

香加皮杠柳苷；癌，肺，人；細胞凋亡；survivin表達

香加皮(CortexPeriplocae)為蘿藦科植物杠柳(PeriplocasepiumBge.)的干燥根皮，是我國的傳統中藥，主要用于祛風濕，強筋骨[1]。近年來，本課題組研究者對中藥香加皮抗腫瘤作用進行研究，發現從中分離純化得到的單體化合物香加皮杠柳苷(periplocin fromCortexPeriplocae，CPP)具有明顯的抗腫瘤活性[2-3]。本實驗在前期工作的基礎上，通過研究CPP對人肺癌A549細胞凋亡及其相關基因survivin表達的影響，進一步探討CPP誘導細胞凋亡的抗腫瘤分子機制。

1 材料與方法

1.1 藥物與細胞株 CPP由華北制藥集團新藥研究開發中心分離純化(含量≥99.8%)[4]。人肺癌A549細胞由河北醫科大學第四醫院科研中心凍存，用含10% 胎牛血清(fetal calf serum，FCS)的RPMI-1640完全培養液，于37 ℃，5%二氧化碳(CO2)條件下，常規0.25% 胰蛋白酶消化傳代培養。

1.2 試劑 RPMI-1640培養液、反轉錄多聚酶鏈反應(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)酶混合物(批號：QPG-061)、Trizol Reagent(批號：15596018)為美國GIBCO公司產品；FCS為杭州四季青生物工程公司產品；胰蛋白酶(批號：T1426)、噻唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT，批號：M2128)、吖啶橙(acridine orange，AO，批號：A8120)、溴乙啶(ethidium bromide，EB，批號：E1385)、碘化丙啶(propidium iodide，PI，批號：P4170)為美國Sigma公司產品；DNA Ladder為華美生物工程公司產品；survivin及β-actin引物由上海生物工程公司合成；兔抗人survivin、β-actin多克隆抗體(批號：RAB0536，FK0097A)為美國Santa Cruz公司產品；RIPA裂解液、辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)標記的羊抗兔IgG二抗(批號：ZB-2301)、電致化學發光(electrochemiluminescence，ECL)試劑盒為北京中杉金橋生物有限公司產品。

1.3 主要儀器 TC2323 CO2恒溫培養箱(美國SHELDON公司)，HT2酶標儀(奧地利Anthos公司)，IX70倒置熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，H-7500透射電鏡(transmisson electron microscope，TEM，日本日立公司)，Epics-XLⅡ流式細胞儀(flow cytometry，FCM，美國Beckman Coulter公司)，定量PCR儀(美國ABI公司)，凝膠成像分析系統(美國Perkin-Elmer公司)。

1.4 MTT法檢測A549細胞的增殖情況 取對數生長期的A549細胞，接種于96孔培養板，每孔細胞數約為1×104個。設對照組和1.25，2.50，5.00，10.00，20.00 ng·mL-1CPP實驗組，每組設3個平行孔，置37 ℃、5%CO2培養箱均分別培養24，48，72 h。實驗終止前每孔加入5 mg·mL-1MTT 10 μL繼續培養4 h，棄去培養液，每孔加入二甲亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)150 μL，待結晶溶解后用酶標儀于波長570 nm測定吸光度(A)值，計算細胞增殖抑制率(inhibitory rate，IR)。IR(%)=(1-實驗組平均A值/對照組平均A值)×100%。

1.5 FCM檢測細胞凋亡和凋亡率 分別取培養6，12，24，48，72 h的對照組和2.50，5.00，10.00 ng·mL-1CPP組A549細胞約1×106個，以70%預冷乙醇固定，PI染色，應用流式細胞儀測定細胞凋亡率，進行細胞凋亡分析。

1.6 熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡形態 采用AO/EB熒光雙染法，分別取對照組和經5.00 ng·mL-1CPP作用48 h的A549細胞約1×105個，用0.25%胰蛋白酶消化收集，將細胞懸液100 μL，加入100 μg·mL-1AO/EB混合熒光染色液4 μL混勻，取1滴立即置熒光顯微鏡下觀察CPP處理前后A549細胞的形態學變化。

1.7 TEM 觀察細胞凋亡的超微結構 收集對照組和經5.00 ng·mL-1CPP作用48 h的A549細胞，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)洗滌、離心，2.5%戊二醛固定，1%鋨酸后固定，經脫水、包埋、切片，鈾鉛雙重染色后，采用透射電鏡觀察細胞超微結構變化。

1.8 RT-PCR檢測survivin基因mRNA表達 取對照組和2.50，5.00，10.00 ng·mL-1CPP組作用48 h 的A549細胞，用Trizol提取液提取各組細胞總RNA。按RT-PCR酶混合物試劑盒說明進行實驗，以β-actin為內參照，每批PCR均設空白對照，反應35個循環。survivin及β-actin基因的引物序列為[5-6]：survivin上游5′-AGCCCTTTCTCAAGGACCAC-3′，下游5′-GCACTTTCTTCGCAGTTTCC-3′，擴增片段大小為363 bp；β-actin上游5′-CGCTGCGCTGGTCGTCGACA-3′，β-actin下游5′-GTCACGCACGATTTCCCGCT-3′，擴增片段大小為619 bp。將RT-PCR產物行瓊脂糖凝膠電泳，應用凝膠成像系統Gel-pro軟件分析條帶的灰度值，對survivin mRNA表達水平進行半定量分析。

1.9 Western blot檢測survivin蛋白的表達 分別收集對照組及經2.50，5.00，10.00 ng·mL-1CPP處理的A549細胞，用RIPA裂解液提取各組細胞總蛋白，BCA法蛋白定量，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrop-horesis，SDS-PAGE)1.5 h，將蛋白轉至硝酸纖維素膜，封閉過夜，加入兔抗人survivin和β-actin抗體封閉2 h，洗膜30 min，加入HRP標記的羊抗兔IgG二抗封閉1 h，洗滌后加入ECL顯影，通過凝膠成像系統攝像分析。

2 結果

2.1 CPP對A549細胞增殖的影響 MTT結果顯示，1.25，2.50，5.00，10.00，20.00 ng·mL-1CPP組的A549細胞，在作用24，48，72 h后，細胞增殖均受到不同程度抑制，與對照組比較，細胞增殖抑制率顯著增高(P<0.05)。CPP對A549細胞的增殖抑制作用隨藥物濃度增加和作用時間延長而增強，抑制率最高達(93.46±2.35)%，見圖1。

2.2 細胞凋亡的FCM檢測結果 經過2.50，5.00，10.00 ng·mL-1CPP作用48 h后A549細胞可見典型的凋亡峰，隨藥物濃度增加峰值增高(圖2)。3個濃度的CPP處理組A549細胞的凋亡率明顯增高，并隨藥物濃度增加和作用時間延長呈升高趨勢，與對照組比較，作用48 h和72 h的CPP各濃度組細胞凋亡率均差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

Fig.1 Effects of CPP at different concentration on the proliferations of A549 cells(n=3)

2.3 細胞凋亡的形態學變化 熒光顯微鏡下觀察AO/EB染色細胞，對照組A549細胞呈正常活細胞形態，大小正常，形態規則，細胞質呈綠色，細胞核為亮綠色。CPP處理組A549細胞呈橘紅色，體積縮小，圓形固縮，為典型的凋亡細胞形態(圖3)。

表1 CPP對A549細胞凋亡率的影響

與對照組比較，t12 h=-17.208,t24 h=-9.642,-8.707；t48 h=-7.999,-10.346,-17.353；t72 h=-13.675,-16.179,-25.615,*1P<0.05

Compared with control group，t12 h=-17.208,t24 h=-9.642,-8.707；t48 h=-7.999,-10.346,-17.353；t72 h=-13.675,-16.179,-25.615,*1P<0.05

圖3 CPP誘導A549 細胞凋亡的AO/EB染色結果(×400)

A.Control group；B.CPP group

Fig.3 AO/EB staining on A549 cell apoptosis induced by CPP(×400)

2.4 細胞凋亡的超微結構改變 TEM下觀察可見，對照組A549細胞形態大小規則，染色質均勻分布，細胞器形態結構正常。經CPP處理后的A549細胞，呈典型的凋亡細胞形態，表現為體積變小，胞膜表面微絨毛減少，細胞質凝縮，核內染色質凝聚邊集于核膜，內質網擴張，細胞質空泡化等特征性超微結構改變(圖4)。結果提示，CPP可誘導A549細胞凋亡。

圖4 透射電鏡下A549細胞的超微結構變化(×4 000)

A.Control group；B.CPP group

Fig.4 Ultrastructure changes of A549 cells observed by transmission electron microscope(×4 000)

2.5 CPP對survivin基因mRNA表達的影響 RT-PCR檢測結果顯示，不加RNA的空白對照無任何條帶，而對照組和CPP各處理組(2.50，5.00，10.00 ng·mL-1)可見特異性擴增條帶，與標準DNA ladder比較，分別為內參照β-actin和survivin，經CPP作用48 h后，A549細胞survivin mRNA的表達量明顯減低，隨藥物濃度增加變化更明顯(圖5)。半定量結果顯示，對照組survivin mRNA的表達量(0.928±0.016)，10.0 ng·mL-1CPP組降至(0.251±0.012)，各濃度組與對照組相比其mRNA表達均差異有統計學意義(均P<0.05)(圖6)。提示CPP可使凋亡抑制基因survivin的mRNA表達水平下降。

2.6 CPP對survivin基因蛋白表達的影響 Western blot結果顯示，通過灰度分值比較，與對照組比較，CPP組A549細胞中 survivin蛋白表達均明顯減弱(圖7)。提示CPP可下調survivin基因的蛋白表達水平。

M.100 bp DNA ladder；A.對照組；B.2.50 ng·mL-1CPP組；C.5.00 ng·mL-1CPP組；D.10.00 ng·mL-1CPP組；E.空白對照組

圖5 CPP對survivin基因 mRNA表達的影響

M.100 bp DNA ladder；A.Control group；B.2.50 ng·mL-1CPP group；C.5.00 ng·mL-1CPP group；D.10.00 ng·mL-1CPP group；E.Blank control group

Fig.5 Effects of CPP on mRNA expression of survivin

A.對照組；B.2.50 ng·mL-1CPP組；C.5.00 ng·mL-1CPP組；D.10.00 ng·mL-1CPP組；與對照組比較，*1P<0.05

圖6 CPP作用A549細胞前后survivin mRNA相對表達量分析

A.Control group；B.2.50 ng·mL-1CPP group；C.5.00 ng·mL-1CPP group；D.10.00 ng·mL-1CPP group；Compared with control group，*1P<0.05

Fig.6 Relative mRNA expression of survivin in A549 cells before and after CPP treatment

A.對照組；B.2.50 ng·mL-1CPP組；C.5.00 ng·mL-1CPP組；D.10.00 ng·mL-1CPP組

圖7 不同濃度CPP對survivin蛋白表達的影響

A.Control group；B.2.50 ng·mL-1CPP group；C.5.00 ng·mL-1CPP group；D.10.00 ng·mL-1CPP group

Fig.7 Effects of CPP at different concentration on protein expression of survivin

3 討論

我國是世界上肺癌患者最多的國家，過去30年間，我國肺癌病死率上升46.8%，成為上升速度最快的癌癥，預計到2025年，我國每年死于肺癌的人數將近100萬人[7-8]。 然而，目前尚缺乏療效強、不良反應小的抗腫瘤藥物，有關研究仍是醫學領域關注的熱點。

我國是世界上最大的藥材生產國，以其傳統中草藥的理論和數千年臨床實踐的積累，有著巨大開發潛力和明顯的優勢[9]。作者通過對大量中草藥的抗腫瘤活性篩選，發現中藥香加皮(CortexPeriplocae)具有明顯的抗腫瘤作用，并從中分離純化出單體化合物CPP。本實驗通過研究CPP對人肺癌A549細胞的誘導凋亡作用和凋亡相關基因survivin的表達情況，探討CPP的抗腫瘤機制。

細胞凋亡在腫瘤的發生發展中扮演著關鍵的角色，也是藥物發揮抗腫瘤作用的重要機制之一[10-11]。作者在增殖抑制實驗發現，香加皮杠柳苷(CPP)能顯著抑制人肺癌A549細胞的生長。FCM結果顯示，2.50，5.00，10.00 ng·mL-1CPP組A549細胞可見凋亡峰，細胞凋亡率也明顯增高。提示CPP可誘導人肺癌A549細胞凋亡。

凋亡細胞具有特征性的形態學改變，本研究應用熒光染色和透射電鏡檢測細胞形態發現，CPP處理后的A549細胞出現典型的凋亡細胞形態。熒光染色可見正常活細胞呈均勻分布的綠色熒光，而凋亡細胞呈橘紅色熒光。透射電鏡可見凋亡細胞等超微結構改變。進一步表明CPP能誘導人肺癌A549細胞發生凋亡。

細胞凋亡相關基因survivin是凋亡蛋白抑制因子(inhibitor of apoptosis proteins，IAP)家族的成員[12-13]，具有抑制細胞凋亡和調節細胞有絲分裂的雙重功能，是至今發現最強的凋亡抑制因子[14]。由于survivin的抗凋亡特性及其在腫瘤發生、發展中的重要作用，使其成為抗癌治療的理想靶點[15-16]。本實驗應用RT-PCR和Western blot方法，從mRNA和蛋白水平檢測CPP對A549細胞中survivin表達的影響，結果顯示，CPP組A549細胞中survivin的mRNA和蛋白表達均明顯減弱。提示CPP誘導細胞凋亡可能與survivin基因的表達下調有關。

以上研究結果從細胞凋亡率、形態學觀察以及凋亡抑制基因survivin的檢測等角度，初步揭示CPP對人肺癌A549細胞的誘導凋亡作用，survivin可能是CPP抗腫瘤作用機制中的靶分子之一，有待進一步深入研究。

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DOI 10.3870/yydb.2015.06.001

Effects of Periplocin from Cortex Periplocae on Apoptosis of Human Lung Cancer A549 Cells and Expression of Survivin

ZHANG Jing1, ZHANG Chao2, YANG Guang3, SHAN Baoen2, LIU Jianghui2

(1.DepartmentofRehabilitation； 2.ScientificResearchCenter； 3.DepartmentofRadiology,theFourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,China)

Objective To investigate the effects of periplocin fromCortexPeriplocae(CPP) on apoptosis of human lung cancer A549 cells and expression of survivin, and demonstrate its anti-tumor effect and the possible mechanism. Methods Inhibitory effect of CPP at different concentrations (1.25, 2.50, 5.00, 10.00, 20.00 ng·mL-1) and for different time length (24, 48, 72 h) on A549 cell proliferation was tested by MTT method.Apoptosis rate of A549 cells treated with CPP at different concentrations (2.50, 5.00, 10.00 ng·mL-1) were measured using flow cytometry (FCM) for 6, 12, 24, 48, 72 h, respectively.The morphological and ultrastructural changes of the apoptosis cells were observed by acridine orange/ethidium bromide (AO/EB) staining and transmission electron microscopy (TEM).The effects of CPP on mRNA and protein expression of apoptosis associated gene survivin were assessed by RT-PCR and Western blotting. Results CPP could significantly inhibit the growth of A549, and the inhibition rate reached (93.46±2.35)%.The results of FCM showed that the apoptosis rate of A549 cells treated with CPP was increased significantly as compared to the control group (P<0.05).Meanwhile, typical apoptotic peaks were detected.The characteristic morphological changes of apoptosis were observed in A549 exposed to CPP, including cell shrinkage, the nuclei became yellow-red by AO/EB staining, and typical ultrastructural changes, including nuclear chromatin condensation along the nuclear membrane, vacuolar degeneration of cytoplasm observed by TEM.The result of RT-PCR indicated that survivin mRNA expression decreased obviously in A549 cells exposed to CPP.The protein expression of survivin in A549 cells treated with 10.0 ng·mL-1CPP(0.251±0.012)was weaker than that in control group(0.928±0.016). Conclusion CPP can induce apoptosis in human lung cancer cell lines A549, and the probable mechanism is related to the down-regulation of survivin mRNA and protein.

Periplocin fromCortexPeriplocae； Cancer, lung, human； Cell apoptosis; Expression of survivin

2014-06-04

2014-07-24

*國家自然科學基金資助項目(30772752)

張靜(1971-)，女，河北正定人，主任醫師，博士，主要研究方向：抗腫瘤研究。電話：0311-86095595，E-mail：zjingzher@163.com。

R730.5；R285.5；R734.2

A

1004-0781(2015)06-0705-06