免疫共刺激分子PD-1與PD-L1在乳腺癌中的表達及意義

張　亞，彭成浩

(1.無錫市第九人民醫院病理科，江蘇 無錫 214000； 2.棗莊市立醫院腫瘤研究所，山東 棗莊 277000)

免疫共刺激分子PD-1與PD-L1在乳腺癌中的表達及意義

張亞1，彭成浩2※

(1.無錫市第九人民醫院病理科，江蘇 無錫 214000； 2.棗莊市立醫院腫瘤研究所，山東 棗莊 277000)

摘要：目的探討免疫共刺激分子程序性死亡分子1(PD-1)及其配體PD-L1在乳腺浸潤性導管癌的表達及意義。方法收集2012年1月至2015年1月棗莊市立醫院和無錫市第九人民醫院經手術及病理診斷證實為乳腺浸潤性導管癌且臨床資料完整的患者67例，采用免疫組織化學法檢測PD-1 和PD-L1在乳腺乳腺浸潤性導管癌組織及癌旁組織中的表達，進一步分析PD-1和PD-L1的表達與患者年齡、發病時月經狀態、腫瘤部位、腫瘤大小、淋巴結轉移等臨床病理參數的關系。結果乳腺癌組織中PD-L1與PD-1的陽性率分別為70.2%(47/67)和70.2%(47/67)，其癌旁組織中PD-L1 與PD-1的陽性率分別為32.8%(22/67)和62.7%(42/67)。不同腫瘤的組織學分級、腫瘤大小及淋巴結轉移與否的PD-L1和PD-1的陽性表達率比較差異有統計學意義(P<0.05)。乳腺癌腫瘤組織分化程度越低，PD-L1和PD-1的表達陽性率越高；出現淋巴轉移的乳腺癌患者癌組織中PD-L1 和PD-1表達率明顯高于未出現淋巴轉移者(P<0.05)；腫瘤越大，乳腺癌組織中PD-L1和PD-1的表達陽性率越高。結論PD-1和PD-L1在乳腺癌組織中呈高表達，與腫瘤的侵襲轉移關系密切，是預后差的重要指標之一，有望成為乳腺癌治療的新靶點。

關鍵詞：乳腺癌；程序性死亡分子1及其配體；臨床病理；預后；治療靶點

全球乳腺癌發病率自20世紀70年代開始逐年增高，我國乳腺癌的發病率近年來明顯上升，嚴重危害女性身心健康。近年來興起的免疫治療已成為繼手術、化療和放療后的一種新的腫瘤有效治療手段。針對人類表皮生長因子受體2(human epithelial growth factor receptor 2,Her-2)異常擴增的靶向藥物赫賽汀的廣泛應用，使一部分Her-2過表達型乳腺癌患者明顯獲益。然而，仍有許多患者如三陰性乳腺癌對激素及赫賽汀等治療反應差，預后不良。研究顯示，程序性細胞死亡分子1(programmed cell death 1,PD-L1)是新近發現的B7家族的免疫調節分子(B7 homolog 1,B7-H1)，具有免疫正性刺激作用，其配體為白細胞分化抗原28(cluster differentiation 28,CD28)家族成員的負性刺激受體PD-1[1]，廣泛表達于多種免疫細胞、上皮細胞以及腫瘤細胞，主要與腫瘤的免疫逃逸關系密切[2]。近年來研究顯示，人類許多腫瘤尤其是乳腺癌高表達免疫共刺激分子PD-L1，有望成為腫瘤治療的新靶標[3-6]。目前，有關乳腺癌中PD-L1的系統研究國內報道較少。本研究應用免疫組織化學法檢測PD-L1及其配體PD-1在乳腺浸潤性導管癌及癌旁組織的表達，比較其表達水平與臨床病理參數的關系,可望為尋找乳腺癌治療的新靶點提供理論依據。

1資料與方法

1.1一般資料收集2012年1月至2015年1月在棗莊市立醫院和無錫市第九人民醫院經手術及病理診斷證實為乳腺浸潤性導管癌且臨床資料完整的患者67例，年齡≤51歲30例，>51歲 37例；月經狀態：未絕經43例，已絕經24例；腫瘤部位：外上+外下40例，內上+內下13例，中央區14例；組織學分級：Ⅰ級26例，Ⅱ級26例，Ⅲ級15例；淋巴結轉移:陰性40例，陽性27例；腫瘤大?。褐睆健? cm 34例，2 cm<直徑≤5 cm 27例，直徑>5 cm 6例。每例患者均選取腫瘤組織和癌旁組織進行分析，癌旁乳腺組織取自67例乳腺癌患者距離癌組織2.5 cm以外的對應乳腺組織。

1.2實驗方法67例乳腺浸潤性導管癌腫瘤組織和癌旁組織標本均進行免疫組織化學檢測PD-L1的表達。免疫組織化學檢測采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶法。實驗操作嚴格按照說明書進行。4%甲醛固定，石蠟包埋組織2～3 μm常規切片，脫蠟至水，乙二胺四乙酸抗原修復液行抗原修復，過氧化氫處理，按說明書滴加相應抗體，采用二氨基聯苯胺顯色。即用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶法免疫組織化學試劑盒、兔抗人PD-L1及PD-1抗體、濃縮型二氨基聯苯胺顯色試劑盒等所用試劑均購自福州邁新試劑有限公司。同時分析PD-1和PD-L1的表達與患者年齡、發病時月經狀態、腫瘤部位、腫瘤大小、淋巴結轉移等臨床病理參數的關系。

PD-1和PD-L1細胞染色陽性表達為細胞膜和細胞質，呈清晰的棕黃色顆粒，細胞不著色或著色率<20%判斷為陰性表達，細胞著色率≥20%判斷為陽性表達[3]。

1.3統計學方法應用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析，計數資料比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1臨床病理特點67例乳腺浸潤性癌均為女性，年齡30～78歲，中位年齡51歲；單側乳腺發病者60例，雙側乳腺發病者7例；67例病例病理學檢查證實為乳腺浸潤性導管癌(封三圖1)，癌旁乳腺組織經病理檢查無腫瘤細胞浸潤(封三圖2)。所有患者術前未行放化療或任何其他抗腫瘤治療。

2.2PD-L1和PD-1在乳腺浸潤性導管癌及癌旁組織中的表達免疫組織化學結果顯示，67例乳腺浸潤性導管癌組織中，腫瘤組織PD-L1分子陽性率為70.2%(47/67)，其癌旁組織中PD-L1陽性率為32.8%(22/67)，差異有統計學意義(χ2=18.67,P<0.05)(封三圖3、圖4)。

67例乳腺浸潤性導管癌組織中，腫瘤組織PD-1分子陽性率為70.2%(47/67)，其癌旁乳腺組織中PD-1陽性率為62.7%(42/67)，差異無統計學意義(χ2=2.22,P>0.05)(封三圖5、圖6)。

2.3PD-L1和PD-1在乳腺癌組織中的表達水平與臨床病理參數的關系不同年齡、發病時月經狀態以及腫瘤部位PD-L1 和PD-1的陽性表達率比較差異無統計學意義(均P>0.05)；不同腫瘤的組織學分級、淋巴結轉移情況、腫瘤大小的PD-L1 和PD-1的陽性表達率比較差異有統計學意義(P<0.05)。乳腺癌腫瘤組織分化程度越低，PD-L1和PD-1的表達陽性率越高；出現淋巴轉移的乳腺癌患者癌組織中PD-L1和PD-1表達率明顯高于未出現淋巴轉移者；腫瘤越大，乳腺癌組織中PD-L1和PD-1的表達陽性率越高。見表1。

a與Ⅰ級或5 d≤2 cm比較,P<0.05

3討論

免疫共刺激分子PD-L1是在免疫應答中起重要作用的凋亡相關蛋白，能誘導T淋巴細胞與其配體PD-1結合后向T細胞傳遞抑制性信號出現凋亡，調節外周T細胞的免疫耐受，在機體抗腫瘤免疫應答過程中發揮重要作用[1]。 近年來研究發現，PD-L1廣泛表達于人類多種腫瘤組織中，如卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、宮頸癌、腎癌等腫瘤組織微環境，能增加腫瘤反應性T淋巴細胞的凋亡和降低其免疫原性，與腫瘤的免疫逃逸關系密切，提示抗腫瘤免疫可能通過PD-1/PD-L1信號通路調控[2]。腫瘤組織中PD-1/PD-L1通路與腫瘤逃避免疫系統的破壞，是目前腫瘤研究中普遍關注的免疫治療目標。用藥物阻斷PD-1/PD-L1通路能增強T細胞功能，引起腫瘤細胞裂解將為腫瘤治療打開另一個新的窗口[3]。

研究顯示，乳腺癌組織中PD-L1的表達水平與腫瘤的組織學分級相關[3-4]，有望成為繼Her-2之后乳腺癌治療的又一個新的免疫治療靶標。本研究結果顯示，67例乳腺浸潤性導管癌組織中，腫瘤組織中PD-L1陽性率為70.2%，其癌旁組織中PD-L1陽性率為32.8%，差異有統計學意義(P<0.05)。腫瘤組織PD-1陽性率為70.2%，其癌旁組織中PD-1陽性率為62.7%，差異無統計學意義(P>0.05)，說明PD-1和PD-L1 在乳腺浸潤性導管癌腫瘤組織中呈一致性高表達，進一步分析發現PD-1和PD-L1的表達與患者的腫瘤大小、組織學分級以及是否有淋巴結轉移等臨床病理參數相關。

PD-L1在腫瘤的免疫應答過程中對腫瘤細胞的增殖具有重要影響，同時在相當程度上弱化了腫瘤的免疫原性，從而促進腫瘤細胞的免疫逃逸，在腫瘤的侵襲和轉移中發揮至關重要的正性刺激作用[3]。Chen等[5]研究發現，PD-L1在胃癌組織中的表達水平與腫瘤組織的浸潤深度有關，同時PD-L1高表達的腫瘤細胞株的侵襲性高于PD-L1低表達細胞株。乳腺癌研究中，Ghebeh等[4]評估了44例乳腺癌組織中PD-L1表達水平與患者臨床病理參數間的關系，發現PD-L1的表達并不局限于上皮乳腺組織也存在于淋巴細胞，與腫瘤大小、組織學分級、腫瘤浸潤淋巴細胞、HER2/neu狀態等相關預后因素關系密切，但與雌、孕激素受體的表達關系不大，認為PD-L1 可能是乳腺癌患者的重要危險因素之一。進一步研究顯示，乳腺癌組織中PD-L1的表達與腫瘤細胞增殖之間直接關聯[6]；同時乳腺癌組織中調節性T淋巴細胞的共表達PD-L1 和Foxp3也是一個預后差的指標[7]。Muenst等[8]研究也證實，乳腺癌組織中PD-L1的表達與預后差關系密切。Chawla等[9]認為PD-L1在乳腺癌細胞中異常表達，在腫瘤微環境中能招募調節性T細胞免疫逃逸，誘導腫瘤細胞高度增生而導致預后差，而化療藥物阿霉素能下調乳腺癌細胞表面的PD-L1的表達。Mittendorf等[10]研究認為，PD-L1可作為三陰性乳腺癌治療的重要靶點。本研究結果顯示，隨著腫瘤大小的增加、分化程度的降低和淋巴結轉移的出現，PD-L1和PD-1的表達率逐漸升高。推測由于PD-L1和PD-1的高表達促使腫瘤細胞的免疫逃逸，增加了增殖、侵襲和轉移的機會，是值得深入研究的重要靶點。

綜上所述，PD-L1作為B7家族的重要成員，以其獨特的生物學功能在腫瘤免疫逃逸中發揮著重要作用，乳腺癌中PD-1與PD-L1的高表達與腫瘤的侵襲、轉移關系密切，推測阻斷PD-1/PD-L1通路可作為乳腺癌的潛在治療靶點，尤其是對三陰性乳腺癌的治療帶來了新的希望。

參考文獻

[1]Ostrand-Rosenberg S,Horn LA,Haile ST,etal.The programmed death-1 immune-suppressive pathway:barrier to antitumor immu-nity[J].J Immunol,2014,193(8):3835-3841.

[2]Soares KC,Rucki AA,Wu AA,etal.PD-1/PD-L1 blockade together with vaccine therapy facilitates effector T-cell infiltration into pancreatic tumors[J].J Immunother,2015;38(1):1-11.

[3]Hasan A,Ghebeh H,Lehe C,etal.Therapeutic targeting of B7-H1 in breast cancer[J].Expert Opin Ther Targets,2011,15(10):1211-1225.

[4]Ghebeh H,Mohammed S,Al-Omair A,etal.The B7-H1 (PD-L1) T lymphocyte-inhibitory molecule is expressed in breast cancer patients with infiltrating ductal carcinoma:correlation with important high-risk prognostic factors[J].Neoplasia,2006,8(3):190-198.

[5]Chen L,Deng H,Lu M,etal.B7-H1 expression associates with tumor invasion and predicts patient′s survival in human esophageal cancer[J].Int J Clin Exp Pathol,2014,7(9):6015-6023.

[6]Ghebeh H,Tulbah A,Mohammed S,etal.Expression of B7-H1 in breast cancer patients is strongly associated with high proliferative Ki-67-expressing tumor cells[J].Int J Cancer,2007,121(4):751-758.

[7]Ghebeh H,Barhoush E,Tulbah A,etal.FOXP3+ Tregs and B7-H1+/PD-1+ T lymphocytes co-infiltrate the tumor tissues of high-risk breast cancer patients:Implication for immunotherapy[J].BMC Cancer,2008,8(8):57.

[8]Muenst S,Schaerli AR,Gao F,etal.Expression of programmed death ligand 1 (PD-L1) is associated with poor prognosis in human breast cancer[J].Breast Cancer Res Treat,2014,146(1):15-24.

[9]Chawla A,Philips AV,Alatrash G,etal.Immune checkpoints:A therapeutic target in triple negative breast cancer[J].Oncoimmunology,2014,3(3):e28325.

[10]Mittendorf EA,Philips AV,Meric-Bernstam F,etal.PD-L1 expression in triple- negative breast cancer[J].Cancer Immunol Res,2014,2(4):361-370.

The Significance of Co-stimulatory Molecules PD-1 and PD-L1 Expression in Breast CancerZHANGYa1，PENGCheng-hao2.(1.DepartmentofPathology,WuxiNinthPeople′sHospital,Wuxi214000,China; 2.TumorResearchInstituteofZaozhuangMunicipalHospital,Zaozhuang277000,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the clinical significance and expression of co-stimulatory molecular PD-1 and PD-L1 in breast invasive ductal cancer.MethodsFrom Jan.2012 to Jan.2015 in Zaozhuang City Hospital and Wuxi Ninth People′s Hospital,67 patients after surgery with pathologic confirmed invasive ductal carcinoma with complete clinical data were included.The expression of PD-1 and PD-L1 were detected in the breast cancer tissue and adjacent normal breast tissue using immunohistochemistry.The relationship between the expression of PD-1/PD-L1 and clinical pathological parameters such as patients′ age,menstrual status,tumor size,pathologic grade,and lymph node metastasis were analyzed.Results PD-L1 and PD-1 positive rate in breast cancer tissue was 70.2%(47/67) and 70.2%(47/67) respectively,the PD-L1 and PD-1 positive rate of the cancer adjacent tissues were 32.8%(22/67) and 62.7%(42/67).PD-L1 and PD-1 expression rate of different histological gradings,tumor sizes and lymph node metastasis state was statistically significantly different(P<0.05).The lower the breast tumor tissue differentiation,the higher PD-L1 and PD-1 expression positive rate;PD-L1 and PD-1 expression in with lymph node metastasis was signifi-cantly higher than those without lymph node metastasis(P<0.05);the bigger the tumor size,the higher the PD-L1 and PD-1 expression positive rate.ConclusionThe expression of PD-1 and PD-L1 in breast cancer tissue is high,which is closely related to the tumor invasion and metastasis,and is one of the important indicators of poor prognosis,and is expected to become a new target for the treatment.

Key words：Breast cancer; Programmed death-1/programmed death-ligand 1; Clinical pathology; Prognosis; Therapeutic target

收稿日期：2015-05-28修回日期：2015-09-25編輯：伊姍

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.24.046

中圖分類號：R737.9

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)24-4547-03