干細胞相關標志物Oct-4在宮頸癌組織中的表達及臨床意義

劉 紅，房朝暉，張倩影，李魁秀，樊小妹，程建新

(1.河北醫科大學第四醫院婦瘤科，河北 石家莊 050011;2.河北醫科大學第四醫院婦產科，河北 石家莊 050011)

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·論 著·

干細胞相關標志物Oct-4在宮頸癌組織中的表達及臨床意義

劉 紅1，房朝暉1，張倩影1，李魁秀1，樊小妹1，程建新2*

(1.河北醫科大學第四醫院婦瘤科，河北 石家莊 050011;2.河北醫科大學第四醫院婦產科，河北 石家莊 050011)

目的探討干細胞相關標志物Oct-4在宮頸癌組織中的表達并分析其在宮頸癌發生、發展中的作用和意義。方法選取宮頸癌患者的組織檢查標本50例，正常宮頸組織標本20例，采用免疫組織化學法和反轉錄聚合酶鏈反應(reversetranscriptionpolymerasechainreaction,RT-PCR)法檢測正常宮頸組織和不同分化宮頸癌組織Oct-4mRNA的表達量，比較兩者Oct-4蛋白表達陽性率以及宮頸癌患者在不同病理情況下Oct-4蛋白表達的陽性率。結果RT-PCR檢測顯示Oct-4mRNA在宮頸癌組織中的表達明顯高于正常宮頸組織，免疫組織化學染色顯示正常宮頸鱗狀上皮組織不表達Oct-4蛋白，宮頸癌組織中陽性表達率為56.0%(P<0.01)。Oct-4蛋白表達在宮頸癌患者的不同年齡和不同病理類型之間差異無統計學意義(P>0.05)，但在低分化的宮頸癌組織中明顯高于中高分化的宮頸癌組織，在宮頸癌復發轉移者明顯高于臨床治愈者(P<0.01)。結論Oct-4基因在宮頸癌組織中表達增加，表達程度隨著宮頸癌細胞的分化而降低，可能在宮頸癌放療抵抗中起重要作用。

宮頸癌；Oct-4；放射治療；轉移；復發doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.11.008

宮頸癌是發病率較高的女性惡性腫瘤之一,約35%的宮頸癌患者在最初治療結束后3年內出現復發和轉移[1]，一旦發生轉移或復發則預后極差。因此，如何預防宮頸癌轉移和復發是治療宮頸癌成敗的關鍵。盡管近年來在治療宮頸癌方面，放療技術不斷改進，但治愈率并未明顯改善[2]。其主要原因是腫瘤組織抗拒放療。腫瘤干細胞理論認為腫瘤細胞來源于腫瘤干細胞，腫瘤干細胞具有自我更新、多向分化潛能、抗拒放化療及高致瘤性等特點，是腫瘤生長、侵襲、轉移和復發的根源[3-4]。因此，從腫瘤干細胞的角度深入探索宮頸癌的轉移和復發機制，可以為治療宮頸癌提供新的思路和方法。干細胞相關標志物Oct-4被認為是細胞全能性的標志，用于維持細胞的多能性狀態，敲除胚胎干細胞的Oct-4可導致細胞的分化及干細胞特性的消失[5]。研究表明，Oct-4在生殖細胞來源及生殖系統以外的惡性腫瘤中均有陽性表達[6]。有學者認為，表達Oct-4基因的成人干細胞，在腫瘤發生過程中起著重要作用，是導致癌變的一種靶細胞。由于腫瘤初始形成過程中某些不可逆基因改變阻止了分化，因而阻止了Oct-4的消失，保留了其超常自我更新的能力，導致無限制的擴增，形成腫瘤[7-8]。但Oct-4蛋白的表達水平與宮頸癌細胞的生物行為及臨床病理特征之間的關系尚不明確，此方面的研究甚少[9]。本研究應用免疫組織化學、反轉錄聚合酶鏈反應(reversetranscriptionpolymerasechainreaction,RT-PCR)方法檢測Oct-4在宮頸癌細胞和宮頸癌組織中的表達，探討Oct-4表達與宮頸癌發生發展的關系,以期為宮頸癌的治療提供理論基礎，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集河北醫科大學第四醫院提供的資料完整的2008—2010年50例宮頸癌住院放療患者活組織檢查并經病理證實的標本。年齡24～82歲，中位年齡53歲，治療前均行全身計算機斷層掃描(computedtomography,CT)或正電子發射計算機斷層顯像(positronemissiontomography,PET)檢查，除外遠處轉移患者，其中高分化13例，中分化19例，低分化18例，臨床分期為Ⅱb～Ⅲb期。收集婦科病理檢查中20例非宮頸癌患者的組織檢查標本，年齡28～76歲，中位年齡52歲。所有標本一分為二：一份置于液氮中，用于提取組織的總RNA，進行RT-PCR檢測目的基因mRNA的表達水平；另一份放入中性福爾馬林(10%)固定，再經石蠟包埋固定后切片，進行免疫組織化學染色。

1.2 主要試劑 兔源性Oct-4多克隆抗體(Abcam)；抗兔免疫組織化學染色試劑盒(北京博奧森生物技術有限公司)；RNA提取試劑TRIzol(美國GIBCO公司)；Oct-4、GAPDH引物(上海捷瑞技術有限公司)。

1.3RT-PCR技術檢測Oct-4mRNA的表達 用Trizol法分別提取宮頸癌組織和正常宮頸組織中的總RNA行RT-PCR。20μL的反應體系為：2×UltraSYBRMixture10μL，上游引物(10μL/μm)為0.4μL，下游引物(10μL/μm)為0.4μL，模板(cDNA)為2μL，DEPCddH2O為7.2μL，Total為20μL，所需反應條件為95 ° 15s、60min20s，共循環45次。Oct4基因引物序列：上游為5′-CAGAAGGGCAAGCGATCAAG-3′，下游為5′-GGGCCAGAGGAAAGGACACT-3′，擴增產物100bp。以GAPDH基因為內參照，引物序列：上游為5′-CCTCTGACTTCAACAGCGACAC-3′，下游為5′-TGGTCCAGGGGTCTTACTCC-3′，擴增產物174bp。數據收集及分析采用Rotor-GeneReal-TimeAnalysisSoftware6.1序列檢測系統。△Ct值是每個樣本目的基因的循環閾值(Ct)與內參Ct的差異，以GAPDH為內參基因，采用△Ct(Ct目的-Ct內參)法進行相對定量分析，并以2-△Ct×104作為目的基因mRNA的相對表達量。

1.4 免疫組織化學實驗 宮頸癌或組織檢查標本采用常規方法固定包埋和切片。免疫組織化學采用鏈霉素抗生物素-過氧化物酶(SP)法，Oct-4抗體濃度為1∶100。正常宮頸鱗狀上皮組織作陰性對照，PBS取代一抗作為空白對照，光鏡下觀察Oct-4抗原陽性反應為位于細胞核內的棕黃色均勻細顆粒。任意選擇8～10個高倍視野，選取1 000個瘤細胞中陽性染色細胞，陽性細胞率=(陽性表達瘤細胞數/1 000)×100%。平均光密度分析應用HMIAS-2000型全自動彩色圖像分析系統。

1.5 統計學方法 應用SPSS11.5軟件處理數據。計量資料比較分別采用單因素方差分析和q檢驗；計數資料比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1Oct-4mRNA在正常宮頸組織和宮頸癌組織中的表達 正常宮頸組織和宮頸鱗癌組織的陽性表達率分別為15.0%(3/20)、66.0%(33/50)，宮頸鱗癌組織Oct-4mRNA陽性表達率明顯高于正常宮頸組織(χ2=14.875，P=0.000)。Oct-4mRNA在宮頸鱗癌組織中的相對表達量高于正常宮頸組織，宮頸鱗癌組織中分化和低分化高于高分化，宮頸鱗癌組織低分化又高于中分化(P<0.01)，見表1。

表1 正常宮頸組織與宮頸鱗癌組織Oct-4mRNA表達量比較

組別例數Oct-4mRNA正常宮頸組織2042.15±2.32宮頸鱗癌組織高分化1365.60±1.89*宮頸鱗癌組織中分化1986.30±2.14*#宮頸鱗癌組織低分化1899.10±2.32*#△ F2666.547 P0.000

*P<0.01與正常宮頸組織比較 #P<0.01與宮頸鱗癌組織高分化比較 △P<0.01與宮頸鱗癌組織中分化比較(q檢驗)

2.2Oct-4蛋白在宮頸正常組織和宮頸鱗癌組織中的表達Oct-4蛋白在宮頸鱗癌細胞中表達于核膜上，呈黃色或棕黃色。宮頸癌組織、正常宮頸的Oct-4蛋白陽性表達率分別為56.0%(28/50)和0.0%(0/20)，差異有統計學意義(χ2=18.667，P=0.000)。

2.3Oct-4表達與宮頸癌臨床病理學指標分析結果Oct-4在宮頸癌患者不同年齡、不同腫瘤直徑、不同組織分型間差異均無統計學意義(P>0.05)；在病理分級中，高分化與中分化Oct-4表達陽性率低于低分化(P<0.01)，而中分化與高分化Oct-4表達陽性率之間差異無統計學意義(P>0.05)；宮頸癌復發轉移者Oct-4表達陽性率明顯高于臨床治愈者，差異有統計學意義(P<0.01)。見表2。

表2 宮頸癌患者在不同病理情況下Oct-4的表達

*P<0.01與低分化比較(χ2檢驗)

3 討 論

宮頸癌的轉移方式包括直接蔓延、淋巴結轉移及血行轉移等。肺、腹膜后淋巴結以及骨是最常見的遠處轉移部位。以放療為主的同步放化療是中晚期宮頸癌的主要治療方法。雖然宮頸癌的放療效果較好，然而仍有近35%的患者在治療后出現復發轉移，成為宮頸癌患者死亡的主要原因[10]。腫瘤干細胞是惡性腫瘤中存在的一群數量極少的腫瘤細胞，是腫瘤生長、侵襲、轉移、復發和抗拒放化療的根源[3]。Singh等[11]認為腫瘤干細胞的多少與腫瘤的惡性程度呈正相關，即腫瘤干細胞所占比例越大，惡性程度就越高。

哺乳動物在胚胎發育過程中受多種基因的調控，有序地進行組織分化和個體發育，Oct4基因就是關鍵基因之一。Oct-4由N端的Pou特異域和C端的Pou同源域構成，N端和C端富含羥脯氨酸和酸性殘基的氨基酸，2個亞區則由15～56個氨基酸組成的易變區連接，通過結合ATGCAAAT的八聚體結構域活化相應的靶基因。Oct-4是研究發現最早、也是最重要的維持胚胎干細胞多潛能性和自我更新的基因。在胚胎發育早期可使胚胎干細胞維持未分化狀態,被認為是重要的干細胞標志物[12]。Oct-4作為細胞多能性狀態的最主要調節因子，當細胞未分化時，Oct-4發揮著雙重調節功能。一方面，它可以維持細胞的未分化階段；另一方面，也可以使細胞分化為另一細胞類型，同時它還可將已分化完成的體細胞逆轉成為具有強分化潛能的細胞[13]。此外，Oct-4還可以激活特定的信號通路對細胞增殖分化產生作用，通過前饋系統、信號通路等對多種轉錄因子的表達進行調控[14]。Oct4既可以表達于胚胎以及生殖細胞腫瘤中，也可以表達于非生殖系統腫瘤細胞和組織中[15]。Oct-4在非生殖系統腫瘤細胞中表達的現象可能成為干細胞致癌的一種證據。研究發現，Oct-4雖然在腫瘤干細胞中表達升高，但在已經分化的體細胞中表達下調[16]。在胚胎干細胞中，敲除Oct-4基因后干細胞特性也會隨之喪失[17]。但也有學者認為Oct-4蛋白在非胚胎性腫瘤細胞系和組織中的表達可能是假基因和亞型的影響[18]。因此，Oct-4是否在成體腫瘤組織中表達尚存分歧。

宮頸癌治療后42%～50%的復發轉移癌發生在治療后1～2年內，少數發生在治療后4～5年，5年后再發生則非常少見[19]。我們稱治療結束5年未復發的患者為臨床治愈。因此，本研究分別采用PT-PCR法和免疫組織化學的方法分析了Oct-4基因和蛋白在宮頸癌組織和正常宮頸組織中的表達，以及在不同病理特征、放療后出現轉移復發和臨床治愈患者中的表達狀況，結果顯示宮頸癌組織中Oct-4基因和蛋白的表達明顯高于宮頸正常組織(P<0.01)，Oct-4蛋白表達在患者不同年齡和不同病理類型之間差異無統計學意義(P>0.05)。腫瘤細胞的分化程度與腫瘤的侵襲能力密切相關，分化程度越低，其基因結構及表型越接近原始幼稚的干細胞。本研究結果顯示，Oct-4陽性表達在宮頸浸潤癌的病理組織不同分級中差異有統計學意義(P<0.01)，陽性率隨宮頸癌組織分化程度降低而增加，提示在低分化癌組織中幼稚干細胞樣細胞數量比高分化癌組織要多；同時Oct-4在轉移復發者宮頸癌組織中的表達明顯高于其在臨床治愈者中的表達，這提示Oct-4可以作為評估宮頸鱗癌預后的有效指標。

總之，腫瘤的發生、發展、轉移和復發是一個異常復雜的過程，與許多基因、蛋白及信號轉導通路相關。本研究發現宮頸癌組織中干細胞相關標志物Oct-4的高表達是癌細胞抗拒放療的主要原因和易發生轉移的危險因素之一。針對腫瘤干細胞的靶向治療，有關Oct-4的研究可能為控制宮頸癌的轉移復發、改善宮頸癌患者的預后提供新的治療方向。

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(本文編輯：許卓文)

Expression of stem cell gene Oct-4 in cervical cancer and clinical significance

LIUHong1,FANGZhao-hui1,ZHANGQian-ying1,LIKui-xiu1,FANXiao-mei1,CHENGJian-xin2*

(1.Department of Gynecological Tumor,the Fourth Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050011,China;2.Department of Obstetrics and Gynecology,the Fourth Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050011,China)

ObjectiveToexploretheexpressionofstemcellgeneOct-4incervicalcancer,andevaluateitsrelationshipwithpathologicalcharacteristicsandprognosisofcervicalcancer.MethodsFiftyparaffinsamplesofcervicalcancertissuesand20casesofnormalcervicaltissuespecimenswereobtained.Immunohistochemicalmethodandreversetranscriptionpolymerasechainreatction(RT-PCR)methodwereusedtodetectmRNAexpressionandOct-4proteinpositiverateinthenormalcervicaltissueanddifferentdifferentiationofcervicalcancertissueandOct4positiverateofproteinexpressionunderthedifferentpathologicalconditions.ResultsRT-PCRdetectionshowedthatOct-4mRNAexpressionincervicalcancertissuewassignificantlyhigherthanthatofnormalcervicaltissue(P<0.01).ImmunohistochemicalstainingshowedthatOct-4innormalcervicalsquamousepithelialtissuewasnegative,butthepositiverateincervicalcancerwas56.0%(P<0.01).Oct-4proteinexpressioninpatientswithdifferentagesandpathologicaltypesshowednostatisticalsignificance(P>0.05).But,Oct-4proteininpoorlydifferentiatedcervicalcancergroupwassignificantlyhigherthanthatinhighdifferentiationofcervicalcancertissue(P<0.01).Oct-4proteininpatientswithrecurrenceandmetastasisofcervicalcancerwassignificantlyhigherthanthatofclinicallycuredpatients(P<0.01).ConclusionOct-4incervicalcancerisincreasedanddownregulatedduringcelldifferentiation.AbnormalexpressionofOct-4proteinplaysanimportantroleinradioresistanceofcervicalcancer.

cervicalcancer；Oct-4;recurrence；metastasis；radiotherapy

2015-08-07；

2015-09-14

河北省科學技術研究與發展計劃項目(14277770D)

劉紅(1972-)，女， 河北威縣人，河北醫科大學第四醫院副主任醫師，醫學博士研究生，從事婦科腫瘤診治研究。

*通訊作者。E-mail:jianxin_cheng@263.net

R

A

1007-3205(2015)11-1267-04