緩激肽受體拮抗劑對卵巢癌細胞的作用

陳麗云，鄭麗華，羅 飛，張 玉，蘇素文

(1.河北醫科大學基礎醫學院藥理學教研室，河北 石家莊 050017；2.河北省正定縣人民醫院婦產科，河北 正定 050800；3.河北省正定縣疾病控制中心計劃免疫科，河北 正定 050800；4.河北省計劃生育科學技術研究院生殖醫學中心，河北 石家莊 050071)

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·論 著·

緩激肽受體拮抗劑對卵巢癌細胞的作用

陳麗云1,2，鄭麗華2，羅 飛3，張 玉4，蘇素文1*

(1.河北醫科大學基礎醫學院藥理學教研室，河北 石家莊 050017；2.河北省正定縣人民醫院婦產科，河北 正定 050800；3.河北省正定縣疾病控制中心計劃免疫科，河北 正定 050800；4.河北省計劃生育科學技術研究院生殖醫學中心，河北 石家莊 050071)

目的探討緩激肽B2受體特異性拮抗劑艾替班特(HOE-140)單獨或聯合應用阿霉素(doxorubicin,DOX)對人卵巢癌細胞株SKOV3 的影響及可能的作用機制。方法采用MTT法檢測不同濃度的DOX或HOE-14與SKOV3作用24h后細胞的存活情況。在此基礎上，比較二者聯合用藥和分別單獨應用相同劑量的DOX或HOE-140 對SKOV3的細胞毒作用及對SKOV3 細胞凋亡的影響。結果不同濃度的DOX或HOE-140與SKOV3共同孵育24h后，均對SKOV3細胞的增殖有一定抑制作用。二者聯合應用對SKOV3細胞的抑制作用明顯強于單獨應用(P<0.05)。二者聯合應用誘導SKOV3細胞的凋亡作用明顯強于單獨應用。結論緩激肽受體拮抗劑HOE-140對SKOV3細胞的增殖有一定的抑制作用，并可促進其凋亡。

卵巢腫瘤；受體，緩激肽B2；表柔比星doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.11.007

卵巢惡性腫瘤是女性生殖器官常見的三大惡性腫瘤之一，其中上皮性卵巢癌占卵巢惡性腫瘤的85%～90%，其常用的治療方案為手術加化療，但是多數患者停藥一段時間后會復發，這可能與卵巢癌的發病機制尚不清楚和腫瘤的耐藥有關[1]。卵巢癌的發病機制，目前普遍認可的觀點是與卵巢持續排卵誘發的慢性炎癥有關[2]。緩激肽(bradykinin,BK)是機體炎癥時釋放的一種血管活性肽[3]，通過與細胞膜上的B1受體和B2受體結合產生作用[4]。本研究觀察BKB2受體特異性拮抗劑艾替班特(HOE-140)單獨或聯合應用阿霉素(doxorubicin,DOX)對人卵巢癌細胞株SKOV3 的影響及可能的作用機制，旨在找到更好的腫瘤靶位，從而改善卵巢癌患者的生存質量。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源 實驗所用的卵巢癌SKOV3細胞株由河北醫科大學第四醫院科研中心提供，HOE-140由BIOMOL公司生產。

1.2 實驗方法

1.2.1DOX和HOE-140 單獨或聯合應用對SKOV3 細胞增殖的影響 采用MTT法檢測不同濃度DOX(3、10、30、100、300μmol/L)或HOE-140(0.01、0.1、1、10、100μmol/L)對SKOV3作用24h后細胞的存活情況。在此基礎上，比較二者聯合用藥(DOX10μmol/L+HOE-140 10μmol/L)和分別單獨應用相同劑量的DOX或HOE-140 對SKOV3的細胞毒作用。原理：活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為不溶性的藍紫色結晶甲瓚并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯免疫檢測儀在 490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量。在一定細胞數范圍內MTT結晶形成的量與細胞數成正比，從而檢測細胞增殖及抑制率。

1.2.2DOX和HOE-140 單獨或聯合應用對SKOV3 細胞凋亡的影響 采用DOX10μmol/L、HOE-140 10μmol/L、DOX10μmol/L+HOE-140 10μmol/L聯合應用作用SKOV3細胞24h，采用原位末端標記技術觀察細胞凋亡情況。原理：細胞在發生凋亡時，會激活一些DNA內切酶，這些內切酶會切斷核小體間的基因組DNA。基因組DNA斷裂時，暴露的3′-OH可以在末端脫氧核苷酸轉移酶的催化下加上熒光素標記的dUTP，從而可以通過熒光顯微鏡進行檢測。

1.3 統計學方法 應用SPSS10.0統計學軟件進行數據分析，計量資料比較分別采用F檢驗和q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 2種藥物對SKOV3細胞增殖的影響MTT法檢測結果顯示，不同濃度的DOX(3、10、30、100、 300μmol/L)或HOE-140(0.01、0.1、1、10、100μmol/L)作用SKOV3細胞24h后，均對SKOV3細胞增殖有一定的抑制作用，隨著藥物濃度的增加，抑制作用越來越強(圖1，2)。HOE-140 10μmol/L和DOX10μmol/L對SKOV3細胞的抑制率分別為 12.7%和26.8%，而DOX10μmol/L+HOE-140 10μmol/L聯合應用的抑制率為37.5%，對SOV3細胞的抑制作用明顯強于二者單獨應用(P<0.05)(圖3)。

2.2 2種藥物對SKOV3細胞凋亡的影響TUNEL染色顯示單獨應用HOE-140 10μmol/L或DOX10μmol/L處理SKOV3細胞24h均可誘導SKOV3細胞凋亡，而DOX10μmol/L+HOE-140 10μmol/L聯合應用誘導SKOV3細胞的凋亡作用明顯強于單獨應用(圖4)。

3 討 論

卵巢位于盆腔深部，早期病變不易發現，晚期病例也缺乏有效的治療手段，因此卵巢惡性腫瘤致死率居婦科惡性腫瘤首位，已成為嚴重威脅婦女生命和健康的主要疾病。卵巢癌的組織類型繁多，其中上皮性卵巢癌最為多見。手術加化療是卵巢癌常用的治療方案，化療作為卵巢癌重要的治療方法，其方案的選擇尤其重要，同時化療的不良反應也會凸顯出來。DOX是最有效的化療藥物之一，臨床廣泛用于多種惡性腫瘤如乳腺癌、淋巴瘤、肺癌及卵巢癌等，然而劑量依賴性心臟毒性限制了DOX在臨床的應用，如何減輕其心臟毒性癥狀并增強其抗腫瘤療效，成為目前亟待解決的問題。

BK是機體一種非常重要的促炎癥反應肽類物質，在組織損傷后介導眾多的血管和炎癥反應。BK對機體的作用通過與BK受體(B1R和B2R)結合起效。B1R和B2R均為G蛋白偶聯受體。其中B2R在組織中固有表達，與BK親和力高；B1R正常情況下幾乎不表達，與BK的親和力低，炎癥及損傷等情況下表達量大大增加，故屬誘導型受體。多種因素如多種促炎因子(白細胞介素1)、生長因子(上皮細胞生長因子、腫瘤壞死因子以及脂多糖)及受體激動劑等均可促使B1R表達上調。BK與其受體結合后可激活多種信號通路[5-7]。其中蛋白激酶C通道可通過激活細胞內的第二信使(Ca2+)導致一氧化氮的產生增加[8-9]。

我們以前的研究發現，DOX一次大量給藥(20mg/kg)所致的急性心肌損傷癥狀在BK受體基因敲除小鼠明顯輕于野生型小鼠，且心肌組織中誘導型一氧化氮合酶的表達明顯減弱，提示BK所介導的一氧化氮信號通路可參與DOX所致的心臟毒性，而阻斷這一信號通路則可減輕損傷。最近的研究發現，多種腫瘤如卵巢癌、胃癌和肝癌的的腹腔滲液[10-11]中均有高水平的BK，提示BK可能參與惡性腫瘤的發生，BK受體有望成為惡性腫瘤的治療靶位[8]。但目前對其亞型在腫瘤中的表達及各亞型所起的作用研究尚少，且結果也不一致[8,12]。因此，有必要深入研究BK各亞型及其介導的信號傳導通路在腫瘤發生及增殖中的作用，這將有助于更好地了解腫瘤的發生和增殖機制，以便為臨床更好的聯合用藥提供實驗基礎。

Kuhr等[13]研究認為，在內皮細胞，B2R的激活導致Gαq/11的活化，進而導致內皮型一氧化氮合酶的激活，使一氧化氮瞬時、小量的升高，而B1R被激活后則可通過G蛋白ai亞單位、βγ亞單位和惡性腫瘤基因依賴性ERK/MAP激酶的激活導致一氧化氮含酶的激活[14]。但這一信號通路在卵巢癌的發生發展中是否仍然起作用有待進一步實驗證實。

目前，BK受體拮抗劑已被試用于多種腫瘤，特別是肺癌和前列腺癌的治療[8,10]。但其試用于卵巢癌的研究尚少[12]。

本研究采用人卵巢癌SKOV3細胞株，發現B2R的特異性拮抗劑HOE-140對卵巢癌細胞的增殖有輕度的抑制作用，且可增敏DOX的作用，進一步證實B2受體可參與卵巢癌的發生和發展。對經不同處理的SKOV3細胞做TUNEL染色后發現，HOE-140和DOX均可促進卵巢癌細胞的凋亡。HOE-140作為BKB2R的特異性拮抗劑，可直接抑制BK介導的作用。因此，HOE-140有望成為一種新的、有潛力的抗卵巢癌的藥物。

腫瘤的發生是多因素協同作用的結果,隨著人們對BK及其受體的深入研究,BK及其受體在腫瘤發生發展中的作用和確切的作用機制，以及在腫瘤臨床應用中的價值將逐漸被闡明。本研究結果顯示，BK受體特別是B2R在卵巢癌的發生中有非常重要的作用，其拮抗劑對卵巢癌SKOV3細胞的生長有一定的抑制作用，同時可誘導細胞的凋亡，所以BKB2R拮抗劑有望成為卵巢癌治療的新靶點。不過迄今為止，有關HOE-140的抗卵巢癌作用一直沒有明確的報道，就目前總體而言，對HOE-140的藥理作用尚了解不多。

綜上所述，BK受體拮抗劑HOE-140 和DOX均對SKOV3細胞的增殖有一定的抑制作用，其作用可能與促進細胞凋亡和抑制一氧化氮產生有關。(本文圖見封三)

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(本文編輯：趙麗潔)

The role of bradykinin receptor antagonists in ovarian cancer

CHENLi-yun1,2，ZHENGLi-hua2，LUOFei3，ZHANGYu4，SUSu-wen1*

(1.Department of Pharmacy,the School of Basic Medicine,Hebei Medical University,Shijiazhuang 050017,China;2.Department of Obstetrics and Gynecology,the People's Hospital of Zhengding County,Hebei Province,Zhengding 050800,China; 3.Department of Immunology,Disease Control Center of Zhengding County,Hebei Province,Zhengding 050800,China； 4. Department of Reproductive Medicine Center，Research Institute for Family Planning of Hebei Province，Shijiazhuang 050071，China)

ObjectiveToinvestigatetheinhibitoryeffectsofB2receptorantagonistHOE-140aloneorincombinationwithdoxorubicin(DOX)onhumanovariancancercelllines(SKOV3)andpossiblemechanismsofaction.MethodsSKOV3cellswereculturedinthepresenceofdifferentconcentrationsofHOE-140orDOXfor24h.Then,thesameconcentrationsofHOE-140andDOXaloneorincombinationwereusedtoobservethesynergisticinteractionandtheinfluenceonapoptosisofSKOV3cells.ResultsBothHOE-140andDOXinhibitedtheproliferationofSKOV3cellsinaconcentration-dependentmanner.TheeffectofcombinationonSKOV3cellsshowedasynergisticeffects(P<0.05).Thecombinationeffectofthetwodrugswasstrongerthanmedicationalone.ConclusionBradykininreceptorantagonistHOE-140inhibitedtheproliferationofSKOV3cellsandcanpromoteapoptosis.

ovarianneoplasms;receptor,bradykininB2;epirubicin

2015-07-28；

2015-08-31

國家自然科學基金課題(81273600)；河北省自然科學基金課題(2011206145)

陳麗云(1976-)，女，河北正定人，河北省正定縣人民醫院副主任醫師，醫學碩士，從事婦產科疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail:suswmk@163.com

R

A

1007-3205(2015)11-1264-04