褐飛虱ABCG基因的克隆與表達分析

閘雯俊，王芳芳，李三和，胡剛，陳志軍，劉凱，周雷，楊國才，游艾青

摘要：三磷酸腺苷結合盒轉運蛋白（ATP-binding cassette， ABC）廣泛分布于各種生物體中，是最大的膜蛋白家族之一。在昆蟲中，ABC轉運子不僅在分子轉運過程中有重要的功能，同時在殺蟲劑抗性、代謝和發育中都起到重要的作用?？寺『丸b定了褐飛虱（Nilaparvata lugens St？覽l， BPH）ABCG基因 （NlABCG），結果表明NlABCG基因全長1 222 bp， 含有一個長度為789 bp的開放閱讀框，編碼263個氨基酸。NlABCG蛋白與內華達古白蟻（Zootermopsis nevadensis） ABCG的同源性最高，達到69%。利用qRT-PCR 檢測NlABCG基因在褐飛虱不同發育階段和不同組織中的表達，發現NlABCG 轉錄本在褐飛虱的所有發育階段都有表達，在1齡若蟲中表達量最低，隨著生長發育表達量逐漸升高。NlABCG在褐飛虱5齡若蟲的中腸中表達量最高。NlABCG基因的序列特征和表達譜非常保守，為其功能的分析提供了信息。

關鍵詞：褐飛虱（Nilaparvata lugens St？覽l， BPH）;NlABCG;克隆

中圖分類號：S435 ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2014）23-5871-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn 0439-8114.2014.23.064

ABC 轉運蛋白最早發現于細菌，是細菌質膜上的一種具有運輸功能的 ATP 酶（Transport ATPase），是一個龐大而多樣化的蛋白家族。ABC轉運蛋白是膜整合蛋白，它通過利用 ATP 水解過程釋放的能量對溶質中各種生物分子進行跨膜轉運，其轉運的底物包括糖、氨基酸、金屬離子、多肽、蛋白質、細胞代謝產物和藥物等[1]。ABC 轉運蛋白在生物體內以全分子或半分子轉運蛋白的形式存在，全分子轉運蛋白由2個核苷酸結合域（Nucleotide ?bindingdomain，NBD）和2個跨膜結構域（Transmembrane domain，TMD）構成，每個半分子轉運蛋白包括1個NBD和1個TMD，NBD位于細胞質內，在 NBD內有一個約200個氨基酸構成的保守序列，包含了3個保守區域，分別為Walker A（P-loop）、Walker B和特征基序 C（也稱 Signature 基序或特征基序S）[2]，其中 Walker A和B是所有的核苷酸結合蛋白所共有的，而Signature基序是ABC轉運蛋白特有的。

ABC轉運蛋白可以分為轉入蛋白、轉出蛋白和非轉運蛋白[3]。研究表明在昆蟲中，ABC轉運蛋白的功能已經影響昆蟲代謝和發育[4]。褐飛虱（Nilaparvata lugens St？覽l，BPH）屬同翅目飛虱科昆蟲，又稱褐稻虱。褐飛虱是水稻主要害蟲之一，在我國長江流域和華南及西南廣大稻區發生頻繁、危害嚴重[5]。本研究從褐飛虱體內分離得到NlABCG基因的全長，同時分析了NlABCG基因結構，并對其在發育過程中和不同組織中的表達進行分析， 以期為研究其進化提供新的資料， 為研究褐飛虱NlABCG基因的功能和在ABC轉運蛋白中的價值提供依據。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?材料 ?褐飛虱品種（生物型Ⅱ）為武漢大學收藏，飼養在感蟲水稻品種臺中1號（TN1）植株上，環境條件為（25±2） ℃，80%的相對濕度，光照周期為16 h光，8 h黑暗。

1.1.2 ?試劑 ?試驗所用大腸桿菌E. coli DH5α， ExTaq酶、逆轉錄試劑盒和pMD18-T克隆載體，5′-Full RACE 和3′-Full RACE試劑盒購自Takara 公司。引物合成及序列測定由北京擎科新業生物技術有限公司完成。

1.2 ?方法

1.2.1 ?總RNA的提取 ?使用總RNA提取試劑盒RNAiso Plus提取褐飛虱發育時期和成體不同組織的總RNA。將溶于無核酸酶水中的RNA置于-80 ℃冰箱中備用。

1.2.2 ?cDNA克隆 ?利用Tribolium castaneum的ABC transporter蛋白（GenBank登錄號： XP_97173

5.1）在褐飛虱的ESTs數據庫（http：//bphest.dna.affrc.go.jp/）中進行TBLASTN查詢，得到相應的EST片段。以該EST序列為模板設計RACE引物。以提取的總RNA為模板，使用RACE試劑盒分別合成5′和3′RACE cDNA。以合成的cDNA第一鏈為模板，進行Outer PCR反應和Inner PCR反應，反應引物見表1。Outer PCR反應程序為：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s， 72 ℃延伸2 min， 20個循環后72 ℃再延伸10 min。Inner PCR反應程序與以上程序一樣，只是改為30個循環。PCR 產物利用寶生物工程（大連） 有限公司試劑盒回收，與pMD18-T載體連接。陽性克隆由北京擎科新業生物技術有限公司測序。

1.2.3 ?實時熒光定量PCR檢測NlABCG轉錄差異 ?取不同生長發育時期褐飛虱和褐飛虱不同組織總RNA，按照反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄獲得褐飛虱的cDNA。在Roteogene 6000TM型定量PCR儀上進行10 μL體系的PCR反應，反應條件如下：94 ℃預變性2 min，然后以30～40個循環進行PCR擴增 ?（94 ℃ 20 s， 55 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s） 每個樣品3個重復，取平均值。以褐飛虱Actin作為參照基因，采用2-ΔΔ Ct方法[6]比較不同樣品基因表達水平。endprint

1.2.4 ?生物信息學分析 ?對5′RACE序列和3' RACE 序列測序后拼接獲得cDNA全長。用ExPASy Translate tool軟件（http：//web.expasy.org/translate/）進行翻譯得到相應cDNA編碼框的預測，再利用下列在線工具進行蛋白質序列的功能域及結構域的預測：用Clustalw（http：//www.genome.jp/tools/clustalw/）進行同源序列比對;用MEGA 4.0軟件進行進化樹的繪制;用ExPASy Compute pI/Mw tool（http：//web.expasy.org/compute_pi/）進行分子量和等電點分析;用http：//npsa-pbil.ibcp.fr/進行二級結構的預測。

2 ?結果與分析

2.1 ?褐飛虱NlABCG基因的克隆

以該EST序列為模板設計RACE引物，克隆得到NlABCG基因（GenBank登錄號： KM115648）的5′ cDNA 片段和3′ cDNA片段（圖1）。5′cDNA 序列長度約為0.8 kb，3′ cDNA序列長度約為0.4 kb。全長序列經過測序拼接后，全長為1 222 bp，含有一個編碼263個氨基酸的開放閱讀框（ORF）。

2.2 ?NlABCG蛋白質分析鑒定

NlABCG基因編碼263個氨基酸，結果見圖2。應用Computer pI/Mw Tool軟件分析預測NlABCG的分子量為28.7 kDa，等電點為6.44。二級結構預測分析發現，NlABCG蛋白質α螺旋占35.74%，延伸鏈占15.59%，隨機卷曲占46.01%（圖3）。

通過 NCBI的 Blastp （http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）程序進行在線蛋白質序列比對，結果表明該基因與其他昆蟲的ABCG蛋白序列相似性大于63%（表2）。如，與內華達古白蟻（Zootermopsis nevadensis）ABCG1的同源性為69%，與豌豆蚜（Acyrthosiphon pisum）ABCG4和佛羅里達弓背蟻（ Camponotus floridanus）ABCG4的同源性為67%，與切葉蟻（Acromyrmex echinatior）ABCG4﹑畢氏粗角猛蟻（Cerapachys biroi）ABCG和赤擬谷盜（Tribolium castaneum）ABCG1的同源性為66%，與金小蜂（Nasonia vitripennis）ABCG4的同源性為63%。由此可以看出，褐飛虱NlABCG與其他昆蟲的 ABC 轉運蛋白序列相似性較高，其序列相當保守。

2.3 ?NlABCG分子進化分析

用 NlABCG編碼的氨基酸序列與蜜蜂、家蠶、人體虱、佛羅里達弓背蟻、豌豆蚜、切葉蟻、內華達古白蟻、赤擬谷盜、畢氏粗角猛蟻、金小蜂中可能的ABCG亞族成員進行聚類分析，結果發現NlABCG與內華達古白蟻、赤擬谷盜和豌豆蚜中可能的 ABCG亞族成員聚類在一起，親緣關系較近，而與其他昆蟲的ABCG亞族成員親緣關系相對較遠（圖4）。

2.4 ?褐飛虱NlABCG基因不同生長發育時期和組織的分析

為了解NlABCG基因在褐飛虱不同生長發育階段蟲體中和在蟲體不同組織中的轉錄情況，分別提取1齡至5齡若蟲和雌雄成蟲蟲體的總RNA以及5齡若蟲的中腸、唾液腺、脂肪體、表皮、腿和頭部組織的總RNA，利用實時熒光定量PCR法檢測該基因在褐飛虱不同發育階段蟲體中和不同組織中的表達情況。試驗結果表明，該基因在雌成蟲的表達量較高（圖5）。不同組織中，在中腸的表達量最高（圖6）。

3 ?小結與討論

本研究克隆得到NlABCG基因的全長，并且將氨基酸序列與其他昆蟲的ABCG進行序列比對，發現其與內華達古白蟻、赤擬谷盜、豌豆蚜的ABCG蛋白在進化上親緣關系較近。對褐飛虱ABCG蛋白序列進行分析發現，該蛋白質α螺旋占35.74%，延伸鏈占15.59%，隨機卷曲占46.01%。同時鑒定了NlABCG基因在褐飛虱不同生長發育階段蟲體和在蟲體不同組織中的轉錄情況，該基因在雌性成蟲中的表達量較高。在不同組織中，在中腸的表達量最高。中腸組織是昆蟲腸道組織中惟一與細胞表面直接接觸的。研究表明，家蠶中的ABCG基因是特異表達的，在蛻皮和化蛹期間受20E正調節[7]。

因此，褐飛虱NlABCG基因的表達特征表明，利用農藥防治褐飛虱的最佳時期是在早期。這些結果有利于開發一些以NlABCG基因為靶標的安全有效的殺蟲劑，同時可以利用RNA干擾的方法來抑制ABC轉運蛋白的表達，以達到控制害蟲的目的。

參考文獻：

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[4] VACHE C， CAMARES O， CARDOSO-FERREIRA M C， et al. A potential genomic biomarker for the detection of polycyclic aromatic hydrocarbon pollutants： Multidrug resistance gene 49 in Drosophila melanogaster[J]. Environ Toxicol Chem，2007， 26：1418-1424.

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[7] ?LIU S， ZHOU S， TIAN L， et al. Genome-wide identification and characterization of ATP-binding cassette transporters in the silkworm，Bombyx mori[J].BMC Genomics，2011.DOI：10.1186/1471-2164-12-491.endprint