HPLC法對細梗香草中槲皮素和山奈酚含量的測定

林貴兵，羅光明，許燕萍，沈安，謝安芮，劉勇

摘要：測定了細梗香草（Lysimachia capillipes Hemsl.）中槲皮素和山奈酚含量。用甲醇加熱回流鹽酸水解法，薄層色譜對細梗香草提取液中槲皮素和山奈酚進行定性檢驗;高效液相色譜法（HPLC）同時測定細梗香草中槲皮素和山奈酚含量，色譜條件為ACI C18（250 mm×4.6 mm）色譜柱，流動相為甲醇-0.4%磷酸溶液（60∶40，V/V），流速為1.0 mL/min，檢測波長為368 nm，柱溫為30 ℃。槲皮素在0.24～2.40 μg內線性關系良好，回歸方程為y=0.000 3x-0.006 1，R2為0.997 8，平均回收率為95.91%;山奈酚在0.72～7.20 μg內線性關系良好，回歸方程為y=0.000 2x+0.411 5，R2 為0.997 2，平均回收率為103.06%。細梗香草中槲皮素和山奈酚含量在分別為0.021%與0.065%。

關鍵詞： 細梗香草（Lysimachia capillipes Hemsl.）;槲皮素;山奈酚;HPLC

中圖分類號：O657.7+2 ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? 文章編號：0439-8114（2014）23-5848-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.23.057

細梗香草（Lysimachia capillipes Hemsl.） 又名滿山香，為報春花科植物全草，具有清熱解毒、祛風、止咳、調經、寧神等功效，臨床主要用于感冒咳嗽、風濕痹痛、氣管炎、哮喘、月經不調、神經衰弱等[1]。現代藥理研究表明，細梗香草具有解熱、抗病毒、抗腫瘤等作用。細梗香草中有效成分以黃酮和皂苷為主，還有有機酸、揮發油等[2-6]。呂武清等[7]對細梗香草藥材測定黃酮苷元山奈酚的含量為0.015%～0.085%。唐琍萍等[8]優化了樣品處理方法同時測定槲皮素和山奈酚含量分別為0.006 1%和0.107 0%。因這些方法都采用層析柱對提取液黃酮苷元進行了純化富集，其成分損失較大。本研究采用直接提取法，減少提取工藝對有效成分的損失，優化提取過程，提高效率，節約成本，并用HPLC法測定細梗香草槲皮素、山奈酚含量，使結果更客觀準確。本研究通過測定細梗香草全草中槲皮素與山奈酚含量，為其質量標準的制定提供基礎數據。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗材料

1100型高效液相色譜儀（Agilent公司），配二極管陣列檢測器（DAD）;AB104-N型電子天平（德國Mettler-Toledo公司）;薄層色譜硅膠G（青島海洋化工有限公司）;甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純;試驗用水為去離子水。

槲皮素標準品（批號：20130522，上海金穗生物科技有限公司）與山奈酚標準品（批號：110861-201209，中國食品藥品檢驗研究院），藥材經劉勇副教授鑒定為報春花科珍珠菜屬植物細梗香草（Lysumachia capillipes Hemsl.）的干燥全草（圖1）。

1.2 ?含水量測定

取細梗香草藥材，粉碎后過80目篩，精密稱取粉末2.0 g，平鋪于干燥至恒重的扁形稱量瓶中，精密稱定，打開瓶蓋至105 ℃干燥5 h，蓋好瓶蓋后移至干燥器中，冷卻30 min，再次精密稱定。再于105 ℃干燥1 h，冷卻后稱重，直至連續兩次稱重，重量差不超過5 mg，計算藥材中含水量（%）。

1.3 ?供試品制備

取細梗香草藥材全草同一批次粉末2.0 g，精密稱重置于具塞的玻璃瓶中，精密加入25 mL甲醇，精密稱重，置水浴中加熱回流1 h，冷卻后稱重，補足損失甲醇并混勻;過濾并取濾液10 mL，水浴蒸干，用20 mL甲醇溶解，加入2 mL濃鹽酸，置水浴中加熱回流水解1 h，蒸干，殘渣加甲醇5 mL溶解，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜后即為供試品溶液。

1.4 ?對照品制備

精密稱取槲皮素標準品2.4 mg，山奈酚標準品7.2 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻溶解，濃度分別為槲皮素對照品（Q）0.24 μg/μL、山奈酚對照品（P）0.72 μg/μL，冷藏備用。

1.5 ?薄層色譜

取供試品、槲皮素與山奈酚對照品溶液10 μL分別點于硅膠G薄層板上，以甲苯-醋酸乙酯-甲酸（5∶4∶1，V/V/V）為展開劑，置鹽酸蒸氣飽和的展開缸內，展開，取出，晾干。

1.6 ?色譜系統考察

1.6.1 ?色譜條件 ?色譜柱為ACI C18（250 mm×4.6 mm）柱，流動相為甲醇-0.4%磷酸溶液（60∶40，V/V），流速為1.0 mL/min，檢測波長為368 nm，柱溫為30℃。對照品進樣量為20 μL。

1.6.2 ?線性關系考察 ?分別精密進樣槲皮素與山奈酚混合標準品溶液1、2、4、6、8、10 μL，在上述色譜條件下測定峰面積，將其含量與峰面積進行處理。y表示含量，x表示峰面積;分別得到線性關系和相關系數。

1.6.2 ?精密度試驗 ?精密吸取樣品溶液20 μL，按上述色譜條件重復進樣6次，分別計算槲皮素與山奈酚峰面積RSD值。

1.6.3 ?穩定性試驗 ?精密吸取同一供試品溶液20 μL，按上述色譜條件，在0、1、2、3、4、5 h測定槲皮素與山奈酚峰面積，分別計算其RSD值。

1.6.4 ?重復性試驗 ?取同一批樣品6份，制成供試品溶液，精密吸取20 μL，按上述色譜條件測定槲皮素和山奈酚峰面積，分別計算其RSD值。endprint

1.6.5 ?加樣回收率試驗 ?稱取2.0 g細梗香草藥材粉末，加入5 μL標準品溶液，在“1.3”項操作下制成供試品溶液，每次吸取20 μL，按上述色譜條件進行測定和分析，分別計算槲皮素和山奈酚平均回收率和RSD值。

2 ?結果與分析

2.1 ?含水量

按照2010版藥典規定的方法，對細梗香草全草含水量測定結果為12.43%。

2.2 ?薄層色譜結果

薄層色譜結果如圖2所示，可見在“1.5”條件下，山奈酚與槲皮素分離效果較好，說明“1.3”中供試品制備條件能提取并水解出山奈酚與槲皮素，展開系統合適分離山奈酚與槲皮素。

2.3 ?HPLC系統

線性關系考察結果表明，槲皮素在0.24～2.40 μg內線性關系良好，回歸方程為y=0.000 3x-0.006 1，R2為0.997 8;山奈酚在0.72～7.20 μg內線性關系良好，回歸方程為y=0.000 2x+0.411 5，R2為0.997 2。精密度試驗表明，槲皮素與山奈酚RSD值分別為1.376%、0.367%，說明精密度良好。穩定性試驗結果其RSD值分別為1.51%、1.99%，表明在5 h內樣品比較穩定。重復性試驗中槲皮素的峰面積分別為2 014.3、2 039.1、2 068.6、2 022.3、2 040.0、2 016.8，山奈酚峰面積分別為11 310.9、11 353.1、11 869.9、11 386.6、11 933.0、11 481.2，其RSD值分別為1.00%、2.34%。加樣回收率結果槲皮素和山奈酚平均回收率分別為95.91%、103.06%;RSD值分別為 2.76%、1.12%，結果見表1。

2.4 ?對照品分離

在“1.6.1”色譜條件下，進樣對照品結果（圖3）表明，槲皮素和山奈酚的保留時間分別為5.4 min和8.1 min，分離效果較好。

2.5 ?供試品HPLC圖譜

精密吸取供試品溶液20 μL，在“1.6.1”色譜條件下測定，色譜圖結果如圖4所示。

2.6 ?細梗香草槲皮素、山奈酚含量

本研究對藥材進行了槲皮素與山奈酚含量的測定，結果槲皮素和山奈酚含量分別為0.021%和0.065%。

3 ?小結與討論

3.1 ?提取工藝方法

細梗香草主要有效成分包括黃酮類和皂甙類，以前學者研究黃酮類物質主要采用了柱層析方法富集黃酮類成分，此方法除去了非黃酮類成分，但對黃酮類成分損失較大，本研究采用直接提取鹽酸水解法，損失相對較小，對含量測定相對較為客觀準確。

在用60%、80%、100%甲醇分別進行提取，結果表明純甲醇提取槲皮素、山奈酚提取率最高，水浴加熱時間比較了30、60、90 min提取效果，結果表明提取時間差異不顯著，本課題采用了用純甲醇與水浴加熱60 min。

藥材粉末粗細程度對含量測定的影響，比較了過100、80、60目篩以及粗粉比較，結果表明過100目與80目對有效成分提取含量差異不顯著，而60目以及更粗的粉末幾乎無法提取出黃酮類成分。因此對于細梗香草黃酮類有效成分提取藥材粉末至少要過80目篩。

3.2 ?色譜條件

呂武清等[7]測定山奈酚色譜條件;流動相：甲醇-0.2%磷酸溶液（47∶53，V/V）;流速：1.0 mL/min條件下，山奈酚在約8.6 min處出峰。唐琍萍[8]等測山奈酚與槲皮素的條件;流動相：甲醇-水-磷酸（500∶500∶1，V/V/V） 條件下槲皮素在約9.4 min出峰，山奈素在約16.2 min有一色譜峰。本試驗用色譜柱為ACI C18（250 mm×4.6 mm）柱，修改流動相為甲醇-0.4%磷酸溶液（60∶40，V/V），流速為1.0 mL/min，檢測波長為368 nm;柱溫為30 ℃;進樣量為20 μL。在此色譜條件下，槲皮素和山奈酚的保留時間分別為5.4 min和8.1 min，縮短了出峰時間，提高了效率，節約了試驗成本。

3.3 ?小結

細梗香草中皂苷類成分研究比較清楚，而黃酮類成分研究不多，在藥材中它主要以黃酮苷的形式存在，水解為黃酮苷元后，藥材化學成分特異性不強，需進一步深入研究黃酮類化學成分。細梗香草葉的黃酮類成分含量比莖高，具有顯著差異，這也與采收期密切相關，因此本課題組下一步研究細梗香草不同采收期藥材的含量差異，其成分動態積累的規律，研究其最佳時間，為細梗香草質量控制提供基礎依據。

參考文獻：

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