香菇柄復合酶解工藝研究

高虹，程薇，史德芳，范秀芝，薛淑靜，周康

摘要：采用纖維素酶（A）和中性蛋白酶（B）復合酶系水解香菇柄，確定香菇（Lentinus edodes）柄中風味成分最佳溶出條件。以可溶性蛋白質溶出率和氨基酸釋放率為評價指標，分別考察酶A水解時料液比、pH、添加量、酶解溫度及酶解時間和酶B水解時pH、添加量、酶解溫度和酶解時間對提取率的影響;以游離氨基酸、呈味核苷酸、多糖的溶出率和酶解液感官品質為評價指標，比較了熱水浸提法、纖維素酶單酶解法、復合酶解法3種方法的優劣。結果表明，最適酶解工藝條件為先以0.2%食用菌水解酶A，料液比（m∶V）為1∶6，pH 4.5，溫度55 ℃的條件酶解2 h，在此條件下可溶性蛋白質溶出率為4.12%，然后在酶解液中加入0.15% 酶B，于pH 6.5，溫度50 ℃酶解6 h，在此條件下總氨基酸釋放率為2.16%;復合酶法水解香菇柄所得游離氨基酸、呈味核苷酸、多糖含量、感官評分分別為2.16%、1.57%、7.25%、82分，均優于另外2種方法。

關鍵詞：香菇Lentinus edodes）柄;纖維素酶;中性蛋白酶;復合水解

中圖分類號：S646.1+2 ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2014）23-5823-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.23.051

香菇（Lentinuus edodes）屬擔子菌綱、傘菌目、口蘑科、香菇屬，是繼雙孢菇之后的世界第二大食用菌，在民間素有“山珍”之稱。中國香菇出口貿易量近10年逐步上升，居世界第一位[1]。香菇柄約占香菇干重的20%～30%[2]，因粗韌難嚼，吞咽困難，為了保證香菇的質量和滿足出口要求，必須將其除去。據不完全統計，僅湖北省，香菇加工中每年產生2萬t左右的菇柄，絕大部分都被廢棄，造成了極大的資源浪費。

香菇柄中含有大量的營養活性成分，其中以香菇多糖和膳食纖維最為突出[3-5]。前期本課題組以香菇柄膳食纖維和活性多糖為目標，進行了深入研究[6-9]。實際上，香菇柄中風味成分的含量也十分豐富，由于纖維類物質的包裹，菇柄的風味成分很難釋放，其鮮香味遠不如香菇菇蓋濃郁醇厚。本研究擬應用生物酶解技術，使菇柄風味成分高效釋放，以期為利用菇柄開發菌類調味品提供理論支撐。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

香菇柄：由湖北裕國菇業股份有限公司提供;食用菌水解酶，由酶A（纖維素酶）和酶B（中性蛋白酶）組成，南寧龐博生物工程有限公司提供;纖維素酶，上海東風生化技術有限公司;其他試劑均為分析純。

1.2 ?儀器設備

電熱恒溫水浴鍋（DZKW-D-2型，北京市永光明醫療儀器廠）;紫外可見分光光度計（T6新世紀型，北京普析通用儀器有限公司）;旋轉蒸發儀（RE-52型，上海亞榮生化儀器）;循環水式真空泵[SHZ-D（Ш）型，鞏義市予華儀器有限責任公司];植物粉碎機（LG-500A型，瑞安百信藥機械廠）;低速自動平衡離心機（DT5-4B型，北京時代北利離心機有限公司）;SW-CJ-1FD型超凈工作臺（蘇州凈化設備廠）;自動精密酸度計（pHS-3C型，上海雷磁分析儀器廠）。

1.3 ?試驗方法

1.3.1 ?復合酶解工藝工藝流程 ?香菇柄→粉碎→加水混合→調pH→加熱→加入酶A保溫酶解→再次調pH→加入酶B保溫酶解→滅酶→過濾→低溫減壓濃縮→冷藏備用[10]。

酶A酶解試驗：加入食用菌水解酶酶A進行酶解試驗，以樣品的可溶性蛋白質含量為指標，分別考察料液比、pH、酶A添加量、酶解溫度和酶解時間對酶解的影響。

酶B酶解試驗：取酶A酶解處理后的樣品，加入酶B進行酶解試驗，以樣品的氨基酸含量為指標，考察pH、酶B添加量、酶解溫度和酶解時間對酶解的影響。

1.3.2 ?纖維素酶單酶法酶解工藝 ?工藝條件參照文獻[11]，即：加酶量0.5%、酶解時間2 h、料液比1∶25（m∶V，下同）、pH 6.0、酶解溫度50 ℃。

1.3.3 ?熱水浸提法工藝 ?工藝條件參照文獻[12]，即：料液比1∶30、浸提溫度70 ℃、浸提時間2 h，提取2次。

1.3.4 ?不同工藝香菇柄中活性成分釋放率的比較 ? 對熱水浸提法、纖維素酶單酶法、復合酶解法3種方法釋放香菇柄中游離氨基酸、呈味核苷酸、多糖的效果進行比較。

感官評分：選取9個經過嚴格培訓的評定員組成感官鑒定小組，對不同工藝得到的酶解液的色澤外觀和風味進行綜合評價。總分滿分為100，色澤外觀、風味的評分根據各項指標所占比例（20%、80%）的不同，計算最終得分，評分標準如表1所示。

1.4 ?測定方法

可溶性蛋白質含量測定采用考馬斯亮藍法;游離氨基酸含量測定參照GB/T5009.124—2003 的方法;呈味核苷酸測定參照SB/T 10484—2008的方法;粗多糖含量測定參照NY/T 1676—2008的方法。

2 ?結果與分析

2.1 ?酶A酶解工藝優化

2.1.1 ?料液比對可溶性蛋白質溶出率的影響 ?取一定量香菇柄粗粉，分別按料液比1∶3、1∶6、1∶12、1∶24加水，加入酶A，用量（以底物的質量計算，下同）0.20%，在pH為4.5的條件下恒溫55 ℃水解2 h。由圖1可知，可溶性蛋白質溶出率隨著料液比的倍數增加而升高，當料液比高于1∶6時，可溶性蛋白質溶出率增長趨緩，繼續提高料液比，可溶性蛋白質的溶出率仍有升高，但提高的量不明顯;若料液比過低則提取不徹底，而料液比過高，則降低了提取液的固形物含量，濃縮成本較大，不利于以后的分離。因此，確定料液比為1∶6。

2.1.2 ?pH對可溶性蛋白質溶出率的影響 ?取一定量香菇柄粗粉，按料液比1∶6加水，酶A用量0.20%，在不同pH （3.5、4.5、5.5、6.5）條件下恒溫55 ℃水解2 h，結果見圖2。由圖2可知，可溶性蛋白質溶出率隨著pH的升高先增加后降低，pH 在4.5時可溶性蛋白質的溶出率最高，可能的原因是每種酶都有一個最適pH，當在此條件下反應時，酶的活性最高，反應條件與其偏離的越遠，酶的活性越低，從pH作用的范圍來看，酶A這種纖維素酶最適pH為4.5。

2.1.3 ?酶A添加量對可溶性蛋白質溶出率的影響

取一定量香菇柄粗粉，按料液比1∶6加水，選擇不同酶A添加量（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%），在pH為4.5條件下保溫55 ℃水解2 h，結果見圖3。從圖3可以看出，可溶性蛋白質溶出率隨著加酶量的增加而升高，當酶添加量達到0.2%后，再增加酶用量，可溶性蛋白質溶出率增加緩慢，這可能是由于在低酶濃度的情況下，底物能夠完全與酶結合，從而破壞細胞壁，使其內容物釋放，但在較高酶濃度情況下，底物不能對酶達到飽和，從而使一部分酶分子無法發揮效用。此外，從經濟效益出發，酶添加量不宜過高，因此取0.20%為宜。

2.1.4 ?酶解溫度對可溶性蛋白質溶出率的影響 ?取一定量香菇柄粗粉，按料液比1∶6加水，酶A添加量0.20%，pH 4.5條件下，選擇在不同溫度（40、45、50、55、60 ℃）水解2 h，結果見圖4。每種酶都有一個最適溫度，當在此條件下反應時，酶的活性最高，反應條件與其偏離的越遠，酶的活性越低。由圖4可知，在較低溫度范圍內，隨著溫度的上升酶活性也隨之提高，可溶性蛋白質的溶出增多，在55 ℃左右達到最高，隨著溫度繼續上升將使酶的穩定性下降，部分酶蛋白分子開始失活。因此，選擇酶解溫度為55 ℃適宜。

2.1.5 ?酶解時間對可溶性蛋白質溶出率的影響 ?取一定量菇柄粗粉，按料液比1∶6加水，酶A用量0.20%，pH 4.5，溫度55 ℃，選擇在不同時間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）內進行酶解，結果見圖5。由圖5可知，隨著酶解時間的延長，可溶性蛋白質溶出率逐漸增加，當酶解時間超過2.0 h后，可溶性蛋白質溶出率增加趨緩，可能是在較短的反應時間內，酶分子快速破壞細胞壁，使細胞內容物釋放，隨著時間的延長，細胞壁已經被完全破壞，內容物已充分溶解，使得可溶性蛋白質溶出率升高趨勢變緩，因此，酶解時間確定為2.0 h。

由以上分析可知，食用菌水解酶酶A的酶解工藝條件為料液比1∶6，酶A添加量0.20%，最適pH 4.5，溫度55 ℃，酶解2.0 h，在此條件下可溶性蛋白溶出率為4.12%。

2.2 ?酶B酶解條件

2.2.1 ?pH對氨基酸釋放率的影響 ?取酶A酶解處理后的樣品，選取不同pH （3.5、4.5、5.5、6.5、7.5），酶B添加量0.1%，溫度50 ℃，酶解4 h，結果見圖6。氨基酸的釋放率隨著pH的升高而增加，至6.5左右達到最高，隨后出現下降，由反應結果可知，該酶的pH作用范圍為6～7，因此選擇pH為6.5。

2.2.2 ?酶B添加量對氨基酸釋放率的影響 ?取酶A酶解處理后的樣品，選取不同的酶B添加量（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%），pH 6.5，溫度50 ℃，酶解4 h，結果見圖7。由圖7可知，隨著酶添加量的增加，氨基酸釋放率上升，達到0.15%后，繼續提高添加量氨基酸釋放率上升平緩。綜合考慮成本等因素，選擇酶B添加量為0.15%。

2.2.3 ?酶解溫度對氨基酸釋放率的影響 ?取酶A酶解處理后的樣品，選取在不同溫度（30、40、50、60 ℃）下，酶B添加量為0.1%，pH 6.5，酶解4 h，結果見圖8。由圖8 可以看出，溫度對氨基酸釋放率影響較大。隨著溫度的升高，氨基酸釋放率先增加后降低，溫度低于30 ℃或高于60 ℃均不利于水解，最適溫度為50 ℃。

2.2.4 ?酶解時間對氨基酸釋放率的影響 ?取酶A酶解處理后的樣品，選取不同處理時間（2、4、6、8 h），酶B添加量為0.1%，溫度50 ℃，pH 6.5，結果見圖9。由圖 9 可知，隨著酶解時間的延長，氨基酸的釋放率也隨之增加，當酶解時間超過6 h 后，氨基酸釋放率的增幅趨于平緩，可能是在較短反應時間內，酶分子快速破壞蛋白質分子，使其快速轉化為氨基酸，隨著時間的延長，蛋白質分子大部分被水解成了多肽和氨基酸，使得氨基酸釋放率升高趨勢變緩，考慮到實際生產情況，揮發性物質因水解時間過長損失較大， 對產品的滋味和氣味不利，酶解作用6 h 較為適宜。

由以上分析可知，香菇菇柄經過酶A處理后，酶B進行酶解的最適工藝條件為pH 6.5，酶B添加量 0.15%，溫度50 ℃，酶解6 h。此條件下，總氨基酸釋放率為2.16%。

2.3 ?不同工藝的比較試驗

對熱水浸提法、纖維素酶酶解法、復合酶法3種方法釋放香菇柄中呈味物質的效果進行了比較，結果見圖10。由圖10可知，游離氨基酸、呈味核苷酸和多糖的釋放效果由高到低依次為復合酶法、纖維素酶單酶法和熱水浸提法。復合酶法的氨基酸釋放率較熱水浸提法有大幅提高，復合酶的使用比單獨加入纖維素酶效果更好，因為有蛋白酶參與作用，使胞內溶出的蛋白質加快分解，酶解液中氨基態氮含量得以顯著提高，酶解液風味得到很大改善。復合酶法同時也大幅提高了多糖的溶出率，可能與纖維素酶的破壁作用有關。

2.4 ?酶解液感官判定分析

3種方法制備香菇柄酶解液感官評定結果如圖11所示。從圖11可看出，復合酶酶解液的感官效果最好，評定分數達到82分，其次是纖維素酶解液，而熱水浸提液感官效果較差;感官評價結果與圖10呈味物質比較結果吻合。

綜合分析可知，利用復合酶中不同酶的作用特點進行分步酶解可以達到較好的酶解效果，復合酶法是3種釋放香菇柄中風味成分綜合效果最好的方法。

3 ?討論

通過優化，得到香菇柄復合酶解的工藝條件為料液比1∶6，酶A添加量0.20%，最適pH 4.5，溫度55 ℃，酶解2.0 h，然后調pH至6.5，加入酶B 0.15%，溫度50 ℃，酶解6 h。此條件下，總氨基酸釋放率為2.16%，呈味核苷酸釋放率為1.57 %，多糖溶出率為7.25%;較熱水浸提法和纖維素酶單酶法均有大幅提高。復合酶通過搭配使用，不僅可以提高酶解液中氨基酸等呈味物質的含量，而且改善了產品的感官風味，突出蛋白水解物的特征味[13]，且易與其他呈味成分配伍，賦予食品多層次、圓潤味的特點[14]。香菇柄酶解之后仍有大量殘渣產生，尚需尋求另一種香菇柄高效破壁技術與之協同使用。

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