溶氧對(duì)多粘芽孢桿菌發(fā)酵影響的研究

饒犇，王亞平，李娜，周榮華，廖先清，劉芳，陳偉，張光陽(yáng)，楊自文

摘要：探討溶氧對(duì)于多粘芽孢桿菌發(fā)酵的影響。結(jié)果表明，溶氧量為40%時(shí)，多粘芽孢桿菌的芽孢數(shù)和抑菌物質(zhì)產(chǎn)量均達(dá)到最高值，分別為10×109個(gè)/g和1.2%。在此基礎(chǔ)上又進(jìn)行了通過補(bǔ)料技術(shù)控制溶氧的試驗(yàn)，結(jié)果表明，補(bǔ)料能較好的提高多粘芽孢桿菌的芽孢數(shù)和抑菌物質(zhì)產(chǎn)量，分別達(dá)到15×109個(gè)/g和1.5%。

關(guān)鍵詞：多粘芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）;溶氧;補(bǔ)料發(fā)酵

中圖分類號(hào)：Q813.1 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ?文章編號(hào)：0439-8114（2014）23-5745-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.23.030

多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）是芽孢桿菌科（Bacillaceae）類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，在劃入類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）之前又稱Bacillus polymyxa。多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）的細(xì)胞呈桿狀，（0.5～2.5） μm ×（1.2～10.0） μm，G+C含量為40%～50%;利用周生鞭毛運(yùn)動(dòng)，在膨大孢子囊中產(chǎn)生橢圓型芽孢;最適生長(zhǎng)pH 7，最適溫度為28～30 ℃;兼性厭氧，分解葡萄糖和其他糖類產(chǎn)酸，有時(shí)產(chǎn)氣，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上無可溶性色素，應(yīng)用前景廣闊[1]。

傳統(tǒng)農(nóng)藥和化肥的過量使用導(dǎo)致很多植物病蟲產(chǎn)生抗藥性，造成生態(tài)環(huán)境的惡性循環(huán)，因此高效、安全的微生物農(nóng)藥和生物化肥越來越受到人們的關(guān)注。而多粘類芽孢桿菌能分泌大量的活性物質(zhì)，對(duì)許多細(xì)菌和真菌有抑制活性，能提高植物的抗病能力，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高產(chǎn)量，并能產(chǎn)生多肽類抗菌物質(zhì)，對(duì)植物病原真菌有較好的拮抗活性。它是一種較好的生防細(xì)菌。另外，多粘芽孢桿菌還具有多種酶活、抗氧化和抗腫瘤等生物活性。

多粘芽孢桿菌能產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，比如多粘菌素（Polymyxin），粘菌素（Colistin），環(huán)桿菌素（Circulin）;殺鐮孢菌素（Fusaricidins）等，這些物質(zhì)的產(chǎn)生和產(chǎn)量與發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件密切相關(guān)，如溫度，pH，溶氧，補(bǔ)料與否等[2-4]。在這些因素中間，溶氧是非常重要的一個(gè)因素，且對(duì)于多粘芽孢桿菌自身菌體的生長(zhǎng)和芽孢形成有重要影響。如何根據(jù)多粘芽孢桿菌的特點(diǎn)，合理控制發(fā)酵不同階段的溶氧水平，提高發(fā)酵生產(chǎn)水平，對(duì)其工業(yè)化有重大的意義。

本研究以實(shí)驗(yàn)室分離得到的多粘芽孢桿菌Paenibacillus polymyxa NR1為研究對(duì)象，考察不同溶氧條件下多粘芽孢桿菌的芽孢形成及數(shù)目，以及對(duì)其中幾種抗菌物質(zhì)的產(chǎn)量的影響。

1 ?材料與方法

1.1 ?菌株

多粘芽孢桿菌Paenibacillus polymyxa NR1（實(shí)驗(yàn)室自行篩選）。

1.2 ?培養(yǎng)基

1.2.1 ?種子培養(yǎng)基 ?葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母浸粉2%。

1.2.2 ?發(fā)酵培養(yǎng)基 ?葡萄糖 1%，豆粕2%，蛋白胨1%，酵母粉1%，碳酸鈣0.5%，pH 6.5～7.0。

1.3 ?分批發(fā)酵研究

從斜面上接一環(huán)菌到搖瓶種子培養(yǎng)基中，28 ℃，200 r/min下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后期，以5%接種量接入30 L發(fā)酵罐（上海保興公司），裝料20 L，罐壓0.02 MPa，在發(fā)酵過程中通過空氣流量及攪拌轉(zhuǎn)速控制對(duì)溶氧進(jìn)行控制，因?yàn)榧尤肓颂妓徕}，故pH不予控制。

1.4 ?補(bǔ)料發(fā)酵研究

裝料20 L，罐壓0.02 MPa，轉(zhuǎn)速300 r/min，空氣流量1 vvm，配制60%的葡萄糖補(bǔ)料液，后面根據(jù)溶氧要求靈活的控制補(bǔ)料速率直至芽孢形成。

1.5 ?分析方法

1.5.1 ?溶氧測(cè)定 ?梅特勒溶氧電極在線測(cè)定。

1.5.2 ?菌絲濃度測(cè)定 ?Eppendorf 臺(tái)式離心機(jī)5 000 r/min離心10 min。

1.5.3 ?芽孢數(shù)測(cè)定 ?活菌數(shù)按常規(guī)平板計(jì)數(shù)法測(cè)定[5]，檢測(cè)芽孢數(shù)前，將菌液在80 ℃預(yù)處理20 min，再按照常規(guī)平板計(jì)數(shù)法測(cè)定[6，7]。

1.5.4 ?抗生素含量測(cè)定 ?首先將發(fā)酵液直接凍干成粉末，采用甲醇萃取，萃取液采用HPLC測(cè)定，條件：Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，流動(dòng)相為0.01 mol/L三氟乙酸-乙腈，從77.0%～75.5%二元梯度洗脫;流速為1.0 mL/min;紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為205 nm;進(jìn)樣量為20 μL;柱溫為30 ℃。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?多粘芽孢桿菌臨界氧濃度的確定

多粘芽孢桿菌菌體濃度進(jìn)入穩(wěn)定期之后，突然停止通氣，觀察溶氧電極指數(shù)的變化。由圖1可知，剛開始溶氧直線下降，而當(dāng)其降到約20%時(shí)，下降速率變小。這說明溶氧為20%以下時(shí)，多粘芽孢桿菌的呼吸會(huì)受到影響，也表明該菌是一個(gè)極度高耗氧微生物，溶氧對(duì)其影響非常大，20%的溶解氧濃度是該菌的生長(zhǎng)臨界溶解氧濃度。

2.2 ?不同溶氧下多粘芽孢桿菌發(fā)酵的動(dòng)力學(xué)特征

圖2表明剛開始接種的15 h內(nèi)，發(fā)酵液中溶氧濃度較高，有利于菌體的生長(zhǎng)。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，過高溶氧濃度并不利于多粘芽孢桿菌菌體的生長(zhǎng)。數(shù)據(jù)顯示最佳溶氧是40%，該條件下菌體濃度可以達(dá)到最高，為42%。而由圖3可知，不同溶解氧濃度也影響幾種代謝產(chǎn)物多粘菌素和殺鐮孢菌素等的生成速率及最終發(fā)酵液中它們的含量。圖3顯示溶氧為40%的情況下抑菌物質(zhì)生成速率均要大于其他兩個(gè)溶氧濃度下的生成速率，并且該溶氧條件下抑菌物質(zhì)的最終濃度要大于其他條件下的最終濃度。

2.3 ?不同溶氧下多粘芽孢桿菌芽孢形成的比較

這里考察了不同溶氧對(duì)多粘芽孢桿菌芽孢形成的影響，當(dāng)42 h發(fā)酵結(jié)束時(shí)，測(cè)定芽孢數(shù)，計(jì)算芽孢形成率。從表1中可以得知，當(dāng)溶氧為40%時(shí)，芽孢形成率最高，同時(shí)由于該條件下菌體濃度最高，所以形成的芽孢數(shù)也是最多的。

2.4 ?利用補(bǔ)料技術(shù)控制多粘芽孢桿菌發(fā)酵過程中的溶氧

由于前面試驗(yàn)已經(jīng)證明了該菌是一個(gè)極度高耗氧微生物，而在分批的情況下碳源已經(jīng)全部加入了培養(yǎng)基，這就導(dǎo)致分批發(fā)酵時(shí)的溶氧不會(huì)很好，只能在非常高的轉(zhuǎn)速下（700 r/min以上）才能達(dá)到比較好的溶氧效果，但是這樣的培養(yǎng)條件不利于放大。為此筆者采用補(bǔ)料分批的方法流加碳源， 以提高發(fā)酵過程中的溶氧， 達(dá)到提高芽孢數(shù)和抑菌物質(zhì)產(chǎn)量的目的。當(dāng)溶氧上升時(shí)開始補(bǔ)料，靈活的控制補(bǔ)料速率保存溶氧在40%波動(dòng)， 結(jié)果（表2）表明補(bǔ)料發(fā)酵確實(shí)能提高產(chǎn)品的芽孢數(shù)和生物活性物質(zhì)的產(chǎn)量。

3 ?小結(jié)與討論

多粘芽孢桿菌在自然環(huán)境中棲息廣泛，不僅常見于土壤、植物體表以及植物的根、低莖等部位，而且是常見的植物內(nèi)生細(xì)菌。由于具有良好的抗生作用、溶菌作用、誘導(dǎo)抗性和促生作用等，研究人員將其作為生物農(nóng)藥或者生物肥料施用于大田中，均反饋產(chǎn)生了較好的效果，這促使了相當(dāng)多的研究機(jī)構(gòu)和廠家關(guān)注以及研究該菌[8，9]。但是由于多粘芽孢桿菌比較難形成芽孢以及產(chǎn)素水平較低，市場(chǎng)上較難見到產(chǎn)品。研究了溶氧對(duì)于多粘芽孢桿菌發(fā)酵的影響，發(fā)現(xiàn)過高或者過低的溶氧都不利于其形成芽孢和產(chǎn)素，只有在溶氧為40%時(shí)，發(fā)酵水平才能達(dá)到最高。為達(dá)到該目的，后面又進(jìn)行了通過補(bǔ)料技術(shù)控制溶氧的試驗(yàn)，結(jié)果表明補(bǔ)料能較好的提高多粘芽孢桿菌的芽孢數(shù)和抑菌物質(zhì)產(chǎn)量，分別達(dá)到15×109個(gè)/g和1.5%，以上研究結(jié)果為后面的工業(yè)化打下了良好的基礎(chǔ)。

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