軟腐菌識別侵染魔芋根部影響因子的研究

吳金平，矯振彪，陳磊夫，焦忠久，邱正明

摘要：魔芋（Amorphophallus Konjac）軟腐病頻發(fā)已成為制約魔芋種植業(yè)發(fā)展的瓶頸。目前對其病原、發(fā)病規(guī)律及防治方法等進行了一些研究，加深了對魔芋軟腐病的認識，取得了一定進展，但對魔芋軟腐病的侵染和發(fā)病機制缺乏系統(tǒng)而深入的研究。通過測定軟腐菌（Pectobacterium carotovora subsp.carotovora）在魔芋根表吸附量和根部侵入量，研究不同溫度、pH、接種濃度、LPS和EPS對軟腐菌在魔芋苗根部吸附和侵入過程的影響。結果表明，軟腐菌在魔芋苗根部吸附侵入的最適溫度條件是30 ℃、pH 6.0，隨接種濃度增加吸附和侵入量增加;菌體LPS是魔芋軟腐歐文氏菌對寄主根表的吸附所不可缺少的成分，而EPS預處理對吸附侵入量影響較小。本研究明確不同外界因子（溫度、pH、接種濃度）和細菌識別子（EPS和LPS）在軟腐菌吸附識別魔芋根際中的作用，從源頭上了解軟腐菌對魔芋根系的侵染機制，為研究病害循環(huán)和制訂防治策略提供新的啟示，從根本上有效控制魔芋病害的發(fā)生，并為魔芋的抗病育種提供新思路。

關鍵詞：魔芋（Amorphophallus Konjac）;軟腐菌（Pectobacterium carotovora subsp.carotovora）;吸附;侵入

中圖分類號：S792.39 ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2014）23-5734-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.23.027

魔芋（Amorphophallus Konjac）是自然界中唯一高含葡甘聚糖的特種經(jīng)濟作物，其在食品、醫(yī)藥保健、工業(yè)材料等方面用途廣泛[1]。隨著加工產業(yè)的快速壯大，其種植面積也迅速擴大，據(jù)2013年中國魔芋產業(yè)發(fā)展研討會統(tǒng)計，2013年全國魔芋種植面積已達 169.31 萬畝。但在魔芋種植過程中，魔芋軟腐病病原為軟腐菌（Pectobacterium carotovora subsp.carotovora），一般減產20%～30%，嚴重的達80%，甚至絕收[2]。

自二十世紀八十年代發(fā)現(xiàn)魔芋軟腐病以來，對其病原、發(fā)病規(guī)律及防治方法等進行了一些研究，加深了對軟腐病的認識，取得了一定進展，但對魔芋軟腐病的侵染和發(fā)病機制缺乏系統(tǒng)而深入的研究。很多學者根據(jù)軟腐病菌的侵染特性，認為魔芋軟腐病病原菌是從自然孔口和傷口侵入。Wu等[3]研究發(fā)現(xiàn)，在魔芋軟腐病系統(tǒng)中，軟腐菌可以通過魔芋根系的吸附侵入，導致病害的發(fā)生。

病原細菌與寄主植物在根系的相互作用包括一系列的連續(xù)反應，由接觸、吸附到定殖及其間的相互識別，然后侵人并潛伏，最后導致寄主發(fā)病[4]。因此，研究軟腐病如何識別、吸附、侵染根系的機理，對確定生產中防治重點有重要意義。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

Pectobacterium carotovora subsp.carotovora為湖北省農業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所實驗室保存（Genbank注冊號FJ463871）。魔芋組培苗由湖北省農業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所實驗室提供，高度6～8 cm，生根15～20 d，根長約2 cm。

1.2 ?試驗方法

1.2.1 ?菌種制備 ?將供試菌株在NA培養(yǎng)基30 ℃培養(yǎng)24 h，用無菌水配制成細菌懸浮液，稀釋平板計數(shù)，備用。

1.2.2 ?不同溫度條件下軟腐菌在魔芋根表吸附量和根部侵入量測定 取配好的濃度為6×107個/mL細菌懸浮液50 mL裝入250 mL培養(yǎng)瓶中，分別置于15、20、25、30、35℃的光照培養(yǎng)箱內，待菌懸液的溫度與培養(yǎng)箱內溫度一致后，將魔芋苗放入其中，根部完全浸沒到懸浮液中，每組處理3棵魔芋苗，在浸根接種后0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 h分別剪取幼根，測定不同溫度條件下軟腐菌根表吸附量和根部侵入量。設3次重復，結果取平均值，利用Excel進行數(shù)據(jù)處理。

1.2.3 ?不同pH條件下軟腐菌在魔芋根表吸附量和根部侵入量測定 ?用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH將無菌水pH調節(jié)為5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，分別配制成濃度為6×107個/mL的細菌懸浮液，然后取50 mL相應值的細菌懸浮液放入250 mL培養(yǎng)瓶中，將魔芋苗放入其中，根部完全浸沒到懸浮液中，每組處理3棵魔芋苗，置于30 ℃的光照培養(yǎng)箱內，在浸根接種后0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 h分別剪取幼根，測定不同pH條件下軟腐菌根表吸附量和根部侵入量。設3次重復，結果取平均值，利用Excel進行數(shù)據(jù)處理。

1.2.4 ?不同接種濃度下軟腐菌在魔芋根表吸附量和根部侵入量測定 ?用無菌水分別配制濃度為6×104、6×105、6×106、6×107、6×108個/mL的細菌懸浮液，取50 mL相應值的細菌懸浮液放入250 mL培養(yǎng)瓶中，將魔芋苗放入其中，根部完全浸沒到懸浮液中，每個處理3棵魔芋苗，置于30 ℃的光照培養(yǎng)箱內，在浸根接種后0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 h分別剪取幼根，測定不同接種濃度條件下軟腐菌根表吸附量和根部侵入量。設3次重復，結果取平均值，利用Excel進行數(shù)據(jù)處理。

1.2.5 ?LPS和EPS的吸附和抑制試驗 ?取6×108個/mL濃度細菌懸浮液1 mL加入1 000 mL NA液體培養(yǎng)基，在30 ℃，200 r/min條件下培養(yǎng)18 h，按Baker 等的酚水法提取LPS[5]。按Husain酒精沉淀法提取EPS[6]。參照董漢松等[7]的方法，用LPS和EPS分別對幼苗進行浸根處理，以無菌水作為對照，30 ℃條件下，30 min 后用pH 7.0細菌懸浮液（6×108個/mL） 接種，以不做預處理的接種為對照。30 ℃ 測定幼苗接種1 h 和6 h 后軟腐菌對根表吸附量和根部侵入量。設3次重復，結果取平均值，利用Excel進行數(shù)據(jù)處理。

1.2.6 ?EPS和LPS對菌體的吸附和抑制試驗 ?無EPS和無EPS及LPS菌體懸浮液制備參考董漢松等[7]的方法。分別用濃度為6×108個/mL無EPS及無EPS及LPS的細菌懸浮液處理魔芋苗，以未處理6×108個/mL的細菌懸浮液處理魔芋苗。30 ℃ 測定幼苗接種1 h 和6 h 后軟腐菌對根表吸附量和根部侵入量。設3次重復，結果取平均值，利用Excel進行數(shù)據(jù)處理。

1.2.7 ?根表吸附量和根部侵入量測定方法及根表吸附量測定[8] ?每株每次剪取1條幼根，距離幼根末端約2 cm，將截取的根尖浸入5 mL無菌水中，滌蕩1 min后，取出根尖，用滅菌濾紙吸干外表水分，稱質量，用稀釋平板法統(tǒng)計懸浮液中的細菌數(shù)量，即為軟腐菌的根表吸附量。根部侵入量測定[8]：將稱重后的根尖放入5 mL無菌水中，磨碎，用平板計數(shù)法計數(shù)懸浮液中的細菌數(shù)量，即為軟腐菌的根部侵入量，計算公式為：吸附或侵入量（個/g鮮質量）=細菌濃度（個/mL）×分離用水量（mL）/根質量（g鮮質量）。

2 ?結果與分析

2.1 ?溫度對軟腐菌在魔芋苗根部吸附侵入的影響

由圖1和圖2可知，在整個溫度梯度中，隨溫度升高，根部吸附侵入量逐漸增高，當溫度升至30 ℃時，根部吸附和侵入量最高，35 ℃時根部吸附和侵入量逐漸降低，這可能因為軟腐菌的最適生長溫度為28 ℃，高溫抑制了病菌的生長，所以根部吸附侵入量降低。在所有溫度梯度范圍內，菌株的吸附侵入量都隨時間的延長呈上升趨勢。方差分析表明，不同溫度下軟腐菌在魔芋根部吸附侵入有極顯著差異（P<0.01）。

2.2 ?pH對軟腐菌在魔芋苗根部吸附侵入的影響

從圖3和圖4可以看出，pH 6.0時，魔芋苗根部吸附侵入軟腐病病量均最高，這可能是因為魔芋軟腐菌最適生長pH為6.0～6.5。對在不同pH條件下的魔芋苗根部吸附侵入軟腐病病量進行方差分析，結果表明，不同pH值條件下菌株在魔芋根部吸附侵入軟腐病量都具有極顯著影響（P=0.0001<0.01）。

2.3 ?不同接種濃度對軟腐菌在魔芋苗根部吸附侵入的影響

不同接種濃度條件下軟腐菌在魔芋苗根部吸附侵入量由圖5和圖6可知，隨著接種濃度的增加，軟腐菌吸附侵入量也增加，對菌株在不同接種濃度時的根部吸附侵入量進行方差分析，結果表明，不同接種濃度下軟腐菌在魔芋根部吸附侵入量具有極顯著差異（P=0.0001<0.01）。

2.4 ?軟腐病菌LPS和EPS對病菌的吸附抑制效應

LPS和EPS預處理魔芋根系對隨后接種菌吸附侵入量的影響如表1所示，LPS對軟腐菌的根表吸附和根部侵入都有一定的抑制作用，使其根表吸附量和根部侵入量都有不同程度的下降;但EPS對寄主根系預處理后，對接種菌并無明顯的吸附抑制或增強效應。

2.5 ?洗去EPS及洗去EPS和LPS的菌體對魔芋根部的吸附侵入量

從表2可以看出，洗去EPS/LPS的軟腐菌菌體對魔芋根部的吸附侵入量比洗去EPS高，洗去EPS/LPS和洗去 EPS的軟腐菌菌體對魔芋根部的吸附侵入量比菌液處理的低。

3 ?小結與討論

軟腐菌體對魔芋根部的吸附侵入量隨時間的延長菌量增加，本試驗只做了6 h，主要是因為軟腐菌致病力很強，而實驗材料為幼嫩的魔芋組培苗根部，8 h根部感覺有軟腐癥狀了，12 h整個根部軟腐。

軟腐菌體對魔芋根部的吸附侵入量的最適溫度為30 ℃，最適pH 6.0，這和魔芋軟腐病菌的生物學特性一致[9]。在其生長最適條件下，吸附侵入能力最強。因此，在軟腐病綜合防治中，利用高山氣候或者遮陰作為套種，降低溫度，通過調節(jié)種植地土壤pH，可以有效減慢軟腐病菌的侵染速度，減輕病害危害。但隨著時間的推移，魔芋的根系可對病菌發(fā)生富集作用，使病菌種群數(shù)量增高而達到侵人所需的量。由于根系的富集作用，軟腐菌隨時間的延長菌量增加而達到侵入所需的量[10]。因此，以上綜合防治只能延緩病害的發(fā)生，并不能解決病害問題。

通過LPS和EPS預處理魔芋根系對隨后接種菌吸附侵入量的影響研究可以看出，用LPS處理吸附侵入量都有所降低，而EPS預處理對吸附侵入量影響較小，菌體LPS是魔芋軟腐歐文氏菌對寄主根表的吸附所不可缺少的成分。鑒于LPS在軟腐病菌體接觸識別魔芋根系所表現(xiàn)出來的抑制作用，以從化合物直接利用和基因工程菌株利用途徑進行軟腐病防治，如可借分子遺傳學方法把接觸識別改造為病害控制所用，或獲得病菌吸附缺陷型工程菌株，病菌LPS作為congon的作用，從理論上講，一旦施于根表生態(tài)，可以占據(jù)識別位點而阻止病菌侵人，但這取決于在根表的分布特性、產生和施用技術及經(jīng)濟效益等多因素。

通過本研究，明確不同外界因子（溫度、pH、接種濃度）和細菌識別因子（EPS和LPS）在軟腐菌吸附識別魔芋根際中的作用，從源頭上了解軟腐菌對魔芋根系的侵染機制，為研究病害循環(huán)和制訂防治策略提供新的啟示，為有效控制魔芋病害的發(fā)生和魔芋的抗病育種提供新思路。

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