擬南芥用于除草劑先導化合物篩選的研究

張志剛，楊自文，王開梅，張露云

摘要：采用水瓊脂表面涂布法對擬南芥（Arabidopsis thaliana）的發(fā)芽率和對常用溶劑敏感性進行了試驗，用幾個常用靶標對2個除草劑標準樣品和7個除草劑商品制劑進行了除草活性測定，同時對1 880個微生物源提取物進行了篩選試驗。結果表明，擬南芥用于先導化合物篩選具有穩(wěn)定、高效、操作簡單和敏感性高等突出優(yōu)點;使用擬南芥可有效的減少低活性樣品的漏篩;擬南芥是雙子葉除草劑先導化合物篩選的首選靶標之一。

關鍵詞：擬南芥（Arabidopsis thaliana）;先導化合物;除草活性;微生物源提取物;雙子葉植物。

中圖分類號：S482.4 ? ? ? ? 文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2014）23-5731-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.23.026

除草劑先導化合物篩選與除草劑農藥活性生物測定在靶標設定上有很大差別。除草劑先導化合物篩選對象是低含量、低活性的先導化合物。因為先導化合物在原材料中含量低、活性低，其對常規(guī)的中、低敏感度的農藥生物測定靶標無明顯活性甚至不顯示活性，所以提高檢測敏感度和增加篩選通量是先導化合物篩選成功的關鍵。先導化合物篩選必需使用高度敏感的靶標，以增大具有潛在農藥活性的先導化合物的發(fā)現(xiàn)機率。擬南芥（Arabidopsis thaliana）作為遺傳學和植物發(fā)育研究中的模式生物之一，在農業(yè)科學中所扮演的角色正如小鼠和果蠅在人類生物學研究一樣。擬南芥嚴格自花受粉的特點可以保證種質資源的一致性和穩(wěn)定性。使用擬南芥進行除草劑先導化合物篩選，不僅極大提高篩選的敏感度，減少漏篩，而且突破了使用雜草種子在種子資源少和種子品質差異大等不利因素的限制。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗材料

1.1.1 ?擬南芥種子 ?試驗使用的擬南芥種子為哥倫比亞野生型，由湖北省生物農藥工程研究中心養(yǎng)蟲室提供。試驗用種子保存在具透氣塞的玻璃管中，保存溫度為20 ℃。

1.1.2 ?供試靶標 ?狗牙根、油菜為市售種子，反枝莧種子和浮萍為武漢地區(qū)野外采集。

1.1.3 ?瓊脂粉 ?北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司生產(chǎn)，型號DH010-40。

1.1.4 ?試劑與標準樣品 ?用于靶標表面處理的試劑：75%酒精、2%次氯酸鈉溶液。常用溶劑：丙酮、乙醇、二甲基亞砜（DMSO）、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、甲醇、吐溫-80，以上試劑均為市售分析純化學試劑。除草劑標準樣品：乙草胺（95%）、硝磺草酮（98%）。商品除草劑：氟吡甲禾靈、精異丙甲草胺、精喹禾靈、氯氟吡氧乙酸、水花生必殺（復配）、2甲4氯鈉、2甲4氯二甲胺鹽，以上樣品均為市售商品除草劑。

1.1.5 ?放線菌和真菌發(fā)酵提取物 ?由湖北省生物農藥工程研究中心先導化合物研究室提供。

1.2 ?試驗方法

1.2.1 ?擬南芥種子表面處理及篩選用培養(yǎng)板制備[1] ?稱取1.0 g擬南芥種子置于80 mL離心管中，先用75%酒精浸泡30 s，快速移出酒精，再經(jīng)2%次氯酸鈉溶液浸泡10 min，再以無菌水反復振蕩、浸洗5次以上，最后移除積水備用。把經(jīng)過高壓滅菌后的0.5%的黃原膠50 mL加入盛有1.0 g種子的80 mL離心管中，用旋轉振蕩器振蕩3～5 min，使種子分散均勻，倒入長方形加樣盒中備用。把經(jīng)過高壓滅菌后的0.7%的瓊脂加入96孔組織培養(yǎng)板（深孔）[2]，每孔加入量1 mL，冷卻后備用。把黃原膠與種子混合物轉接到瓊脂表面，接入量為20 μL/孔（接種量為30～40粒種子/孔）。

1.2.2 ?擬南芥種子春化處理試驗[3] ?成熟的擬南芥種子經(jīng)歷低溫進行春化后才能快速同步發(fā)芽。常用的春化方法是播種后，種子與培養(yǎng)基一起進行4 ℃低溫處理（4 d）。這種方法可以用于擬南芥的人工栽培，但不適用于生物測定。所以本試驗采用干燥種子進行低溫春化。干燥的種子春化處理分為5組：第1組收獲后持續(xù)保存在20 ℃;第2組在4 ℃冰箱中春化處理7 d;第3組在4 ℃冰箱中春化處理14 d;第4組在4℃冰箱中春化處理21 d;第5組為在4℃冰箱中春化處理28 d。按1.2.1中的方法把經(jīng)過不同時間春化處理的種子接入96孔組織培養(yǎng)板中的瓊脂上，加蓋培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：溫度18 ℃，相對濕度70%～80%，每天光照9 h，光照強度8 000 lx。每組使用2個組織培養(yǎng)板，重復3次。培養(yǎng)4 d后檢查種子發(fā)芽情況，記錄發(fā)芽率。

1.2.3 ?常用溶劑對擬南芥種子發(fā)芽的影響試驗 ?把丙酮、乙醇、二甲基亞砜（DMSO）、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）和甲醇分別制備成10%的母液。在組織培養(yǎng)板中加入不同量的各溶劑母液。按1.2.1的方法接入擬南芥種子。每個濃度設2組，每組重復3次，5 d后以目測法確定擬南芥生長是否受影響。第1組：接入種子后的組織培養(yǎng)板在無菌操作臺上靜置4 h后，加蓋培養(yǎng);第2組：接入種子的組織培養(yǎng)板直接加蓋后移入人工氣候室培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：溫度18 ℃，相對濕度70%～80%，每天光照9 h，光照強度8 000 lx。

1.2.4 ?除草劑篩選靶標對除草劑標準樣品及商品制劑的敏感性比較[3] ?活性評價指標：根據(jù)活性反應的不同，使用分級指標數(shù)（0、3、5、7、9）標記除草活性[4]。除草劑對常規(guī)篩選靶標的敏感性試驗：將樣品配制成母液，濃度為1.00 mg/mL，以含0.1% 吐溫-80的無菌水稀釋成12個不同的濃度梯度。各組織培養(yǎng)板中瓊脂表面涂布樣品溶液量為0.02 mL/孔，按1.2.1的方法接入擬南芥種子。每個濃度設2個重復，重復試驗3次。培養(yǎng)條件為：溫度18 ℃，相對濕度70%～80%，每天光照9 h，光照強度8 000 lx。7 d后檢查并記錄結果，計算LC50。