現(xiàn)代微生物分類鑒定技術(shù)在白酒釀造中的應(yīng)用

王曉丹，謝曉莉，胡寶東，班世棟，陳美竹，徐 佳，王 婧，邱樹毅*

（1.貴州大學(xué) 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；3.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025；4.河北工程技術(shù)學(xué)院科研處，河北 石家莊 050091）

白酒為中國傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)品，其生產(chǎn)現(xiàn)場的空氣、水源、土壤、原材料以及氣候等條件與環(huán)境微生物的生態(tài)構(gòu)成息息相關(guān)，決定了生產(chǎn)現(xiàn)場微生物多樣性的自然形成和優(yōu)化，構(gòu)成了釀酒發(fā)酵酒曲、窖池窖泥以及糟醅發(fā)酵過程中微生態(tài)環(huán)境與微生物多樣性的相互關(guān)系；而窖池發(fā)酵過程中糟醅固、液、氣三相復(fù)雜的物質(zhì)代謝和能量傳遞過程，決定了傳統(tǒng)醬香型白酒產(chǎn)品的風(fēng)格特征。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)等技術(shù)的迅速發(fā)展，給傳統(tǒng)的微生物分類鑒定帶來了巨大的革新。在傳統(tǒng)的微生物實驗鑒定技術(shù)的基礎(chǔ)之上，利用分子生物學(xué)的發(fā)展成果，通過對決定生物表型特征的遺傳物質(zhì)（即核酸）進行分析，建立一種客觀的、可信度高、重復(fù)性好、分辨能力高、靈敏、快速的分類方法，從而使微生物鑒定從一般表型特征的鑒定，深化到遺傳特性的鑒定，這在一定程度上彌補了傳統(tǒng)微生物鑒定的缺陷。現(xiàn)代分類鑒定技術(shù)使得白酒微生物生態(tài)學(xué)及傳統(tǒng)工藝技術(shù)與酒體風(fēng)味特征的形成等領(lǐng)域，取得突破性的進展，研究白酒在大曲發(fā)酵、釀造過程微生物多樣性構(gòu)成及變化規(guī)律，將現(xiàn)代生物技術(shù)與傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)技術(shù)研究方法有效結(jié)合，并應(yīng)用到發(fā)酵工藝中，構(gòu)建能反映白酒生產(chǎn)體系微生物多樣性變化、相互關(guān)系的微生態(tài)信息庫，解釋白酒的發(fā)酵動態(tài)、微生物菌群與酒質(zhì)的關(guān)系，獲得白酒發(fā)酵過程窖池微生物菌群構(gòu)成及物質(zhì)代謝基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，形成對傳統(tǒng)白酒固態(tài)發(fā)酵機理的最新認(rèn)識。

1 基因序列的同源性分析技術(shù)

基因序列的同源性分析是利用測序結(jié)果與基本本地隊列搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）中的已知序列進行對比，分析同源性，從而對目的菌株進行鑒定。

1.1 16S rRNA/rDNA序列分析

16S rRNA/rDNA序列分析已經(jīng)成為了細(xì)菌種屬鑒定和分類的標(biāo)準(zhǔn)方法。通過將待測菌株的16S rDNA序列進行擴增、測序并進行數(shù)據(jù)的同源性比對分析。然后按照一定的標(biāo)準(zhǔn)，把測序結(jié)果分成若干個操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）。然后將OTU所代表的序列提交到GenBank BLAST數(shù)據(jù)庫中，通過尋找相似度最高的16S rDNA序列，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，就可以對菌株進行準(zhǔn)確、迅速而科學(xué)的定位[1-2]。曾馳等[3]對白云邊酒高溫堆積酒醅過程中的6株不同細(xì)菌進行了分類鑒定，根據(jù)16S rDNA序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)其主要是芽孢桿菌屬（Bacillus）的細(xì)菌。張文學(xué)等[4]運用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增技術(shù)和16S rDNA序列同源性分析等方法測定發(fā)酵60 d的糟醅中原核微生物的16S rDNA基因全序列。真細(xì)菌主要分為6個菌群，古菌主要為產(chǎn)甲烷古細(xì)菌。張霞等[5]從貴州濃香型白酒窖泥和酒醅中分離到了477株細(xì)菌，通過16S rDNA序列分析發(fā)現(xiàn)，地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）在芽孢桿菌屬中占主導(dǎo)，其總數(shù)可以達到32.96%。還有一些不確定的芽孢桿菌和極少量的短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）的不確定菌株。與四川酒廠的微生物類群相比后，發(fā)現(xiàn)有些許差別。湯斌等[6]采用PCR擴增技術(shù)、分子克隆技術(shù)以及序列同源性分析等方法測定安徽古井貢酒酒廠窖池底層窖泥細(xì)菌的16S rDNA，通過與基因數(shù)據(jù)庫中相似菌群序列同源性的比較，得到樣品菌種多樣性，分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示，細(xì)菌含有幾大類群，表現(xiàn)出高度的細(xì)菌多樣性，共分為不可培養(yǎng)細(xì)菌（uncultured bacterium）、梭菌屬（Clostridium）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、真桿菌屬（Eubacterium）和Syntrophomoua五個細(xì)菌分類。劉森等[7]采用16S rRNA基因克隆文庫技術(shù)對四川某濃香型白酒股份有限公司20年窖齡的窖池不同層面的窖泥進行分析，其中細(xì)菌類群及數(shù)量的差異性較大。優(yōu)勢菌群梭菌屬細(xì)菌（Clostridium diolis）及耐酸乳桿菌（Lactobacillus acetotolerans）在上、中、底層窖泥中所占比例分別為34.9%和39.8%、25.2%和20.6%、23.8%和36.6%，枯草芽胞桿菌枯草亞種（Bacillus subtilissubsp.subtilis）是中層窖泥優(yōu)勢菌群之一，占22.1%；古細(xì)菌群落主要分布在甲烷囊菌屬（Methanoculleus）和甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）。Methanoculleus bourgensis在上層和底層窖泥中所占比例分別為89.9%和88.2%。Methanosarcina siciliae和Methanoculleus bourgensis在中層窖泥中所占比例分別為40.7%和49.1%。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示：窖泥細(xì)菌主要為桿菌目、梭菌目、腸桿菌目及以TM7 phylum sp.為代表的種屬分類尚不明確的細(xì)菌，古細(xì)菌主要為甲烷微菌目與甲烷八疊球菌目，其中可能存在這些微生物新的種或亞種。LI X R等[8]根據(jù)16S rRNA文庫，內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔1區(qū)條形碼焦磷酸測序和實時定量PCR技術(shù)分析了汾酒一個輪次夏季發(fā)酵酒醅中超過16S rRNA基因總序列的91%屬于乳酸桿菌科，其中有51%的為耐酸乳酸桿菌，其與檢測到的化學(xué)成分有相似顯著性變化，60%真菌序列歸屬于酵母科，60%內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）區(qū)基因序列歸于酵母菌科，大多與東方伊薩酵母非常相似，其與乙醇和有機酸的成分變化趨勢相似，第二大類的釀酒酵母，是產(chǎn)乙醇重要的種類，而且大約四分之一屬于復(fù)膜孢酵母科。相反，有很少部分序列的霉菌，在發(fā)酵過程中，實時定量PCR（quantitative real-time PCR，RTQ-PCR）顯示，細(xì)菌群落有增長趨勢，而真菌更加穩(wěn)定。

1.2 18S rRNA/rDNA序列分析

原核生物細(xì)胞中的16S rDNA和真核生物細(xì)胞中的18S rDNA的堿基序列都是十分保守的，并且不受微生物所處環(huán)境條件的影響。因此，通過分析比較微生物種之間16S rDNA和18S rDNA的同源性，可以真實的揭示它們的親緣關(guān)系和系統(tǒng)發(fā)育地位。對于真核生物而言，18S rRNA可以鑒定其系統(tǒng)發(fā)育地位。

運用18S rDNA克隆分析技術(shù)鑒定到糟醅中心樣品真菌為主要優(yōu)勢菌；伊薩酵母屬（Issatchenkia）屬酵母菌主要出現(xiàn)在發(fā)酵前中期，藍(lán)狀菌屬（Talaromyces）霉菌主要出現(xiàn)在發(fā)酵前期，而曲霉屬（Aspergillus）霉菌和散囊菌屬（Eurotium）霉菌從發(fā)酵中期開始增多到中后期占絕對優(yōu)勢。主要優(yōu)勢真菌的菌群變化及生物學(xué)特征說明其代謝活動與濃香型白酒糟醅發(fā)酵中大分子物質(zhì)的降解及白酒風(fēng)味物質(zhì)的形成密切相關(guān)[9]。劉念等[10]對四川中西部名酒廠老窖池上層和下層糟酷進行18S rDNA序列同源性分析發(fā)現(xiàn)，白酒糟醅中真菌的優(yōu)勢菌為酵母屬（Saccharomyces）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）、假絲酵母屬（Candida）、漢遜酵母屬（Hansenula）和曲霉屬（Aspergillus）；白酒酒醅發(fā)酵前后均以絲狀真菌為主，且上層糟醅比下層糟醅菌群豐富。發(fā)酵前中期的優(yōu)勢菌為酵母屬（Saccharomyces）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）酵母菌和曲霉屬（Aspergillus），發(fā)酵后期的優(yōu)勢菌為假絲酵母屬（Candida）、漢遜酵母屬（Hansenula）酵母菌和散囊菌屬（Eurotium）。

2 以PCR為基礎(chǔ)的DNA指紋圖譜分類鑒定技術(shù)

由于近年來生物學(xué)在分子水平的發(fā)展，尤其以PCR為基礎(chǔ)的技術(shù)進步，使微生物的分類鑒定進入了分子水平，與傳統(tǒng)的分類鑒定相比其更能準(zhǔn)確、快速地達到鑒定效果，并能鑒定出更多的未知微生物。目前應(yīng)用以PCR為基礎(chǔ)的DNA指紋圖譜鑒定技術(shù)有很多，主要有變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DEEG）技術(shù)、溫度梯度凝膠電泳（temperature gradient gel electrophoresis，TEEG）技術(shù)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（single strand conformation polymorphism，SSCP）技術(shù)、末端限制性片段長度分析（terminal-restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）技術(shù)、熒光PCR技術(shù)、實時定量PCR技術(shù)等。其中DEEG技術(shù)、SSCP技術(shù)、T-RFLP技術(shù)在霉菌的鑒定中是比較常用且很有效的分類鑒定技術(shù)。

2.1 PCR-DGGE克隆分析技術(shù)

PCR-DGGE即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳技術(shù)。其中PCR反應(yīng)是用來在體外特異性擴增目的片段的技術(shù)。DEEG的原理是通過將變性劑甲酰胺和尿素添加到聚丙烯酰胺凝膠中，來形成一個從低到高的線性梯度。由于DNA在同一溫度中的解鏈速率不一樣，則電泳遷移率也不同。由于遷移速率的不同，因而可以使序列不同長度相同的DNA片段得到分離。凝膠條上DNA條帶的強度和數(shù)量可以反映出微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性。然后可以將條帶中所含有的DNA進行PCR擴增、測序以及與數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)比對，通過聚類分析，就可以對微生物進行分類鑒定[11]。溫度梯度凝膠電泳（TEEG）是DGGE技術(shù)發(fā)展出的衍生技術(shù)。在研究清香型白酒大曲酵母菌群落結(jié)構(gòu)時從大曲中共檢測7個真菌分類屬微生物[12]，在研究汾酒大曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)時，得知品溫控制的高低對3種汾酒大曲中細(xì)菌的種類多少和數(shù)量大小的影響較大[13]。

研究DGGE/TGGE膠中單一條帶序列組成的一個比較普遍的方法是先構(gòu)建整個微生物群落的16S rRNA克隆文庫，然后再對文庫中的克隆進行擴增，通過DGGE/TGGE和原始樣品的條帶進行對比，能遷移到相同位置處的克隆序列就是原始條帶所含的序列。利用16S rDNA分析和PCR-DGGE技術(shù)來對醬香型白酒酒醅中乳酸菌群進行分析，對濃香型白酒酒醅微生物進行研究，對江蘇某酒廠兩種香型的2個生產(chǎn)用窖池的微生物進行研究對比了微生物菌群結(jié)構(gòu)。DGGE圖譜分析顯示和通過16S rRNA克降文庫的測序結(jié)果在數(shù)據(jù)庫中的比對，鑒定出在白酒曲藥和酒醅的研究中尚未報道的細(xì)菌屬[14-15]。

2.2 單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（SSCP）技術(shù)

SSCP技術(shù)是根據(jù)DNA或RNA的單鏈構(gòu)象具有多態(tài)性的特點，結(jié)合PCR技術(shù)對基因檢測的分析技術(shù)，它用于分析微生物的基因突變和遺傳學(xué)特征。由于霉菌全長ITS區(qū)序列包含了其兩端的18S rDNA、28S rDNA的部分序列和中間的ITSl區(qū)、5.8S rDNA、ITS2區(qū)的完整序列，擁有相對豐富的信息，因而全長序列的ITS分析在霉菌分子生物學(xué)鑒定中比較常用[16]。分析鑒定方法同ITS區(qū)的一樣。通過PCR-SSCP技術(shù)分析瀘州老窖窖泥中不同窖齡濃香型白酒窖池細(xì)菌群落的變化規(guī)律，可以敏銳的將有差異的分子構(gòu)象分離，從而對細(xì)菌進行分類鑒定[17]。利用SSCP技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)一些在傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)中沒有分離得到的原核微生物種群，對濃香型大曲原核微生物群落的PCR-SSCP研究中每個泳道均出現(xiàn)6～8條比較清晰的條帶，每一條SSCP譜帶中可能同時含有很多類不同的菌群，這樣導(dǎo)致比通過傳統(tǒng)培養(yǎng)得到的微生物類群要少。這個問題是以基因指紋技術(shù)為基礎(chǔ)的群落分析方法無法避免的，這一弱點可以通過大量的克隆測序加以克服。PCR-SSCP技術(shù)在研究原核微生物群落變化情況和評價微生物群落結(jié)構(gòu)的變化上有直觀、方便和快捷的優(yōu)點[18-19]，但SSCP圖譜與群落實際結(jié)構(gòu)符合程度有待提高，這主要是由基因組DNA提取方法和PCR選擇性放大造成的偏差[20]。用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合傳統(tǒng)的培養(yǎng)純化法在分析復(fù)雜的微生物群落結(jié)構(gòu)時可能結(jié)果更為準(zhǔn)確。

2.3 末端限制性片段長度分析（T-RFLP）技術(shù)

T-RFLP是一種分析生物群落的指紋技術(shù)，用于鑒定分析不同微生物群落結(jié)構(gòu)以及它們的多樣性。方法是將真菌或細(xì)菌設(shè)計一對合適的引物，并用熒光物質(zhì)對引物的一端進行標(biāo)記，經(jīng)PCR擴增和酶切后用特定的自動測序儀進行測序。根據(jù)檢測到的帶有熒光標(biāo)記的DNA片段與相應(yīng)數(shù)據(jù)庫進行比對判斷微生物區(qū)系多樣性，可以鑒定到微生物種和屬；根據(jù)熒光強度的強弱可以確定該種的豐度。

該技術(shù)不僅可以進行微生物類群的定性分析，而且可以定量分析，現(xiàn)在已經(jīng)應(yīng)用于微生物的多樣性研究。目前，T-RFLP技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于大曲、酒醅和自然環(huán)境中微生物的多樣性研究中[21-22]。

2.4 擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）分子標(biāo)記技術(shù)

擴增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）標(biāo)記技術(shù)是建立在RFLP基礎(chǔ)上的選擇性聚合酶鏈反應(yīng)，利用可產(chǎn)生粘性末端的限制性內(nèi)切酶酶切研究對象的基因組序列，產(chǎn)生不同長度的酶切片段。將這些酶切片段與含有與其有共同粘性末段的人工接頭連接，形成模板，再在模板末段添加具有選擇性核苷酸（1～3個）的不同引物，然后PCR擴增，結(jié)果只有那些兩端序列與選擇性核苷酸配對的酶切片段被擴增。最后將被擴增的片段在高分辨率的測序膠上電泳，這樣其多態(tài)性即根據(jù)擴增片段的長度與數(shù)量的不同而被分開。由于多態(tài)性存在于整個基因組，所以多態(tài)性高，導(dǎo)致檢測位點多，與物種多態(tài)性具有正向相關(guān)性；DNA用量少（50～100 ng），無需Southern印跡雜交，重復(fù)性好，由于接頭與引物皆為人工特異合成，故不需事先知道研究對象的DNA信息。鄧依等[23]利用ITS-AFLP指紋圖譜分析技術(shù)分析出貴州某酒廠窖壁和窖低的窖泥中的原核微生物在16S-23S rRNA ITS水平上呈現(xiàn)出差異，其中老窖窖底和新窖窖底的原核微生物多樣性存在著明顯差異，其相關(guān)系數(shù)為0.47；而老窖窖壁和新窖窖壁的原核微生物多樣性卻差異不大，其相關(guān)系數(shù)為1.00。向文良等[24]利用16S-23S rRNA ITS AFLP指紋圖譜技術(shù)監(jiān)控四川傳統(tǒng)米酒發(fā)酵過程中原核微生物的演替，并結(jié)合米酒發(fā)酵過程中理化因子的動態(tài)變化分析了其演替過程。

2.5 熒光原位雜交（FISH）技術(shù)

熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）是利用熒光標(biāo)記的特異核酸探針與細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的靶DNA分子或RNA分子雜交，通過在熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描儀下觀察熒光信號，來確定與特異探針雜交后被染色的細(xì)胞或細(xì)胞器的形態(tài)和分布，或者是結(jié)合了熒光探針的DNA區(qū)域或RNA分子在染色體或其他細(xì)胞器中的定位。

吳冬梅等[25]采用FISH分析了窖泥中的微生物，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌（Escherichia coli）及植物乳酸桿菌（Lactobacillus planetarium）的定量表征受到生長期的影響，對數(shù)期和穩(wěn)定期的菌體檢出率＞82%，衰退期的L.planetarium則明顯減少；死菌體比活菌體的檢出信號顯著減弱；經(jīng)硫酸鋁處理，除去腐植酸的窖泥樣品明顯地提高了可辨力，加入窖泥中的E.coliFISH檢出量為光學(xué)顯微鏡訓(xùn)一數(shù)量的46.89%。采用FISH技術(shù)可視化定量表征了窖泥中細(xì)菌和古菌的特征，有益于從細(xì)胞水平研究其微生物群落的關(guān)系。

2.6 宏基因組技術(shù)

宏基因組技術(shù)是直接對樣品中所有微生物的全基因組DNA進行克隆，理論上可以獲得所有微生物的全基因組序列信息。大曲的生產(chǎn)工藝決定了大曲中微生物具有多樣性和復(fù)雜性，大曲生產(chǎn)過程所具有多酶多菌釀造的技術(shù)特征以及白酒開放式的釀造模式，使我國白酒具有獨特的品質(zhì)風(fēng)格。宏基因組分析技術(shù)可以最大限度地解析白酒中微生物種類及其數(shù)量，可以用來分析和研究白酒生產(chǎn)中微生物種類消長變化規(guī)律[26]。利用宏基因組學(xué)技術(shù)可以研究白酒中的可培養(yǎng)和免培養(yǎng)的微生物，它開拓了白酒中微生物的研究領(lǐng)域。利用宏基因組學(xué)技術(shù)從白酒微生物及酶的關(guān)系、整體微生物群落水平兩個方面來研究白酒中微生物，從而篩選得到影響白酒發(fā)酵的功能酶和功能菌和揭示不同大曲酒的微生物群落多樣性及其變化情況。從而較全面了解大曲酒微生物群落的代謝機理和形成大曲酒與眾不同的香味組分的構(gòu)成和風(fēng)味特征[27]。

3 磷脂脂肪酸法分類

磷脂脂肪酸圖譜分析法源于上個世紀(jì)70年代末，主要用于微生物的定量分析，成功地克服了傳統(tǒng)方法的缺點[28]，可以直接研究微生物中復(fù)雜的群落組成及其關(guān)系，是一種快捷、可靠的檢測方法。測定微生物樣品中磷脂脂肪酸的種類和數(shù)量可以真實反映出不同微生物類群的潛在繁殖能力。通過氣相色譜-質(zhì)譜圖譜峰面積分析還可以對微生物中類群進行定性和定量分析，從而確定微生物中類群的種類和數(shù)量，這是磷酸脂肪酸分析法的優(yōu)勢[29-30]。另外，磷脂脂肪酸用來標(biāo)記活體微生物群落，通常在生物體細(xì)胞內(nèi)被認(rèn)為是恒定的[31]。因此，磷脂脂肪酸圖譜發(fā)生改變就可以認(rèn)為是樣品中微生物種類和數(shù)量發(fā)生了動態(tài)變化，即通過磷脂脂肪酸圖譜動態(tài)分析可以揭示樣品中微生物變化過程[32-36]。

4 Biolog微平板

Biolog技術(shù)由美國Biolog公司于1989年開發(fā)成功，最初應(yīng)用于純種微生物的鑒定，至今已經(jīng)能夠鑒定包括細(xì)菌、酵母、霉菌在內(nèi)的近2 000多種病原微生物和環(huán)境微生物[37-38]。Biolog微平板可以用于估價微生物群落代謝多樣性和功能多樣性的研究[39]，與其他鑒定系統(tǒng)相比，Biolog方法在用于環(huán)境微生物的研究時，靈敏度高，分辨力強，并且數(shù)據(jù)的讀取和記錄可以由計算機輔助完成，自動化和標(biāo)準(zhǔn)化程度增高，簡化了鑒定程序，提高了鑒定效率。目前Biolog技術(shù)已成為微生物分類鑒定常用的技術(shù)手段[40-41]。

5 小結(jié)

采用先進的微生物分類鑒定技術(shù)，研究中國白酒制曲、釀造環(huán)境、釀造過程的微生物，對窖池中的發(fā)酵酒醅上、中、下層及不同窖齡的酒醅中微生物進行分類鑒定，了解不同窖齡及不同層微生物的多樣性、微生物數(shù)量、種類的變化規(guī)律。著重分析制曲過程及酒窖內(nèi)發(fā)酵過程中微生物區(qū)系的演變規(guī)律，力求為白酒的窖池發(fā)酵機理提供理論基礎(chǔ)。對堆積過程的微生物，特別是酵母、霉菌和細(xì)菌的變化差異，為討論風(fēng)味物質(zhì)代謝、酶系、白酒風(fēng)格特征等研究提供理論基礎(chǔ)。

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