雞源里默菌的分離和鑒定

劉發志，李占鴻，尹金花，蘇敬良

（1.湖北三峽職業技術學院生物化工學院，湖北 宜昌443000 ；2.中國農業大學動物醫學院農業部動物流行病學與人獸共患病重點實驗室，北京 海淀100193）

里默菌為革蘭陰性、無芽孢、多形態桿菌，屬于黃桿菌科里默菌屬，包括鴨疫里默菌（Riemerella anatipestifer）、鴿里默菌（R.columbina）和鴿咽里默菌（R.columbipharyngis），以及部分尚未完全能確定分類地位的分離株[1-3]。該屬細菌主要分自于家禽和野生鳥類，其中，以鴨疫里默菌感染分布范圍最廣，特別是商品肉鴨的感染給我國水禽養殖造成巨大的經濟損失。有關該屬其他成員的報道逐漸增加，如從有呼吸道癥狀或外表健康的家養鴿子以及鴕鳥中分離到的鴿里默菌和鴿咽里默菌[4-5]。近期的研究發現早期從病雞呼吸道分離的巴氏桿菌屬的部分分離株與里默菌關系密切，但與本屬已鑒定種存在一定的差異，并將其暫時歸類為里默菌分類2 群（Riemerella-like taxon 1）。本試驗自雞呼吸道分離到1 株革蘭陰性桿菌，經過分子生物學檢測該菌株與里默菌分類2 群分離株高度同源。

1 材料與方法

1.1 細菌分離 病料為送檢50 日齡死亡雞，雞群在送檢期間有呼吸道癥狀雞的數量呈上升趨勢，剖檢內部臟器未見有特征性的肉眼病變。完整剝離病雞氣管，在無菌工作臺內用滅菌剪刀將氣管中后段剪開，用滅菌緩沖液浸濕的棉拭子涂擦氣管內壁采樣并直接接種于含5%綿羊血的胰蛋白大豆瓊脂（TSA）培養基上，在燭缸中37 ℃培養過夜。

1.2 細菌鑒定

1.2.1 形態學觀察 挑選單個菌落在添加2%小牛血清的TSA 瓊脂平板劃線培養，經3 次連續傳代純化獲得大小和形態基本一致的菌落后凍存，同時用接種環挑取細菌培養物涂布于載玻片上，火焰固定后進行革蘭染色，在光學顯微鏡下觀察細菌的形態。

1.2.2 16S rRNA 和rpoB 基因序列分析 將分離細菌接種于含2%血清的胰酶大豆肉湯（TSB）中，37 ℃搖振過夜，離心收集菌體，利用細菌DNA 純化試劑盒提取細菌基因組DNA，以細菌16S rRNA 通用引物（27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′/1429R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）和rpoB 基因通用引物（rpoBF：5′-GTTATCAACTCTTTCTTTGGTAC-3′/rpoBR：5′-GCATCATATTAGAACCCAT-3′）進行目的基因擴增，擴增產物經純化后進行核酸序列測定，并與NCBI 數據庫相關基因序列進行比對和分析。

1.3 細菌生長曲線測定 挑取純化的單菌落，接種于含2%胎牛血清的TSB 培養基，37 ℃搖振培養16 h（200 r/min），獲得種子液；用TSB 調節菌液OD600nm=0.1，吸取1 mL 菌液接種于200 mL TSB培養基中，37 ℃搖振培養16 h（200 r/min），每1 h取1 次樣，利用分光光度計測樣品OD600nm 值，繪制細菌生長曲線。

1.4 藥敏試驗 挑取純化的單菌落，接種于含2%胎牛血清的TSB 培養基中，37 ℃，200 r/min 搖振培養過夜，調整細菌濃度至108CFU/mL 左右，均勻涂布于TSA 平板上，用無菌眼科鑷子將藥敏紙片輕輕貼于平板上，37 ℃培養24 h 后，測量抑菌圈直徑。

1.5 致病性試驗 將50 只5 日齡商品代北京鴨分成靜脈注射組20 只，呼吸道感染組20 只，未感染對照組10 只，分別飼養于負壓禽用隔離器中。靜脈注射組每只靜脈注射0.5 mL 新鮮菌液（4×109CFU），呼吸道感染組每只滴鼻感染0.2 mL 菌液（1.5×109CFU）。觀察記錄發病情況。分別于感染后1、3、7 d 每組各撲殺3 只，從血液、肝臟、肺臟和氣管中進行細菌分離培養。

2 結果

2.1 細菌分離培養和形態特征 1 份50 日齡的雞氣管樣品接種至在添加5%血液的TSA 平板培養24 h 后上生長有較為一致的直徑1～2 mm、灰白色、表面隆起、光滑、濕潤的菌落，菌體革蘭染色為陰性短桿狀。經純化培養后，在TSB 培養基中生長良好。細菌接種至新鮮TSB 培養基中經過約4 h 適應后進入對數生長期，之后在接種后11 h進入穩定增長期。

2.2 菌株16S rRNA 和rpoB 基因序列測定及分析

采用PCR 技術對分離株16S rRNA 基因進行擴增獲得預期的目的片段，序列分析結果獲得1 158 nt 可讀序列。比對分析結果顯示，該分離株與鴨疫里默菌16S rRNA 基因的同源性為95.8%，與鴿咽里默菌模式菌8157 株16S rRNA 基因同源性為97.1%，而與里默菌第2 分類群（Riemerella-like taxon 2）的分離株IPDH359/90和IPDH98/90的同源性為98.7%。rpoB基因序列分析結果顯示，該分離株與IPDH 359/90 株相應基因片段的同源性達100%，而與鴿咽里默菌相應片段的同源性為83%。進化分析結果進一步證明HB2013 株與該分類群處于同一分支中（圖1）。綜合16S rRNA 和rpoB 基因分析結果，將該分離株歸類為里默菌第2 分類群，命名為里默菌HB2013 株（Riemerella sp.HB2013）。

2.3 藥敏試驗 紙片擴散法檢測分離細菌對抗菌藥物的敏感性結果發現，在試驗所用的23 種抗菌藥物中，該菌株對頭孢哌酮、頭孢哌酮/舒巴坦、大觀霉素、頭孢西丁、阿莫西林-克拉維酸、左氧氟沙星、利福平高度敏感；對青霉素、氨芐西林、新霉素、阿米卡星、卡那霉素、鏈霉素、紅霉素、羅紅霉素、頭孢噻肟、頭孢吡肟、克林霉素、萬古霉素和四環素中度敏感；對諾氟沙星低度敏感；對阿奇霉素和磺胺甲噁唑不敏感。

2.4 致病性試驗 經靜脈注射和滴鼻兩種途徑感染5 日齡雛鴨與未感染對照組相比，在試驗期內均未表現任何異常。滴鼻感染組在感染后24 h，僅在氣管中分離到少量細菌；兩個感染組在感染3 天后，在血液、肝臟、肺臟和氣管中均未能分離到該細菌。

3 討論

到目前為止，絕大多數里默菌分自鴨、鵝、火雞或鴿，其他宿主來源則較少。我國里默菌感染主要見于水禽（鴨和鵝），是商品肉鴨和鵝最常見的細菌性傳染病之一，但雞源里默菌的分離在國內較為少見。本研究從雞的氣管中分離到里默菌HB2013 株的16S rRNA 基因與鴿咽里默菌，以及Christensen 和Bisgaard 報道[1]的里默菌第2 分類群菌株的同源性均高于97%，但rpoB 基因分析結果顯示，HB2013 株與前者有顯著地差異，與后者高度同源，因此我們將該菌株暫時鑒定為里默菌第2 分類群，其確切歸類可能需要做進一步的表型和遺傳學特征分析。雖然初步研究表明，該菌株對雛鴨沒有明顯的致病性，但其對雞的感染有待進一步探討。

[1] Christensen H，Bisgaard M.Phylogenetic relationships of Riemerella anatipestifer serovars and related taxa and an evaluation of specific PCR tests reported for R.anatipestifer [J].Journal of Applied Microbiology，2010，108：1612-1619.

[2] Rubbenstroth D，Martin Ryll M，Hotzel H，et al.Description of Riemerella columbipharyngis sp.nov，isolated from the pharynx of healthy domestic pigeons（Columba livia f.domestica），and emended descriptions of the genus Riemerella，Riemerella anatipestifer and Riemerella columbina [J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2013，63：280-287.

[3] Vancanneyt M，Vandamme P，Segers P，et al.Riemerella columbina sp.nov.a bacterium associated with respiratory disease in pigeons [J].International Journal of Systematic Bacteriology，1999，49:：289-295.

[4] RubbenstrothD，Hotzel H，Knobloch J，et al.Isolation and characterization of atypical Riemerella columbina strains from pigeons and their differentiation from Riemerella anatipestifer [J].Veterinary Microbiology，2011，147：103-112.

[5] Bocklisch H，Huhn F，Herold W，et al.Ostrich-A new avian host of Riemerella columbina [J].Veterinary Microbiology，2012，154（3-4）：429-431.