hTERT 永生化細胞的研究進展及應用前景

張敏，陳小云，王磊，王棟，蔣桃珍，王靜文

（中國獸醫藥品監察所，北京100081）

hTERT 永生化細胞的研究進展及應用前景

張敏，陳小云，王磊，王棟，蔣桃珍，王靜文

（中國獸醫藥品監察所，北京100081）

人端粒酶逆轉錄酶基因（hTERT）誘導的永生化細胞兼具原代細胞的生物學特性和傳代細胞系連續傳代的能力，是一種理想的細胞來源，在基礎研究、臨床應用和生物工程領域具有無可比擬的優勢。本文主要就hTERT永生化細胞的研究進展及應用前景作一綜述。

永生化；端粒；端粒酶；人端粒酶逆轉錄酶基因（hTERT）

正常細胞因其有限的增殖能力使其在基礎研究、臨床應用和生物工程領域的作用受到局限。在許多實際應用中，理想的是獲得具有持續增殖能力的細胞。一直以來，人們都在試圖解決這一問題，目前用的較多的方法是將SV40病毒、人乳頭瘤病毒、EB病毒等轉染入細胞中，建立永生化細胞系；另外，還可以將原癌基因導入細胞或利用放射性因素、化學藥物的刺激建立永生化細胞，但這些方法建立的永生化細胞均存在使細胞惡性轉化的危險。因此，急切需要發展一種新方法既能讓正常細胞跨越老化這一障礙，又能不丟失其正常特性。近年來報道較多是將人端粒酶逆轉錄酶（hTERT）轉入細胞內使其永生化，并且已經證實這些永生化的細胞跟原代細胞的特性相似，沒有發生核型的改變，也無致瘤性。本文對hTERT介導的永生化細胞研究進展及應用前景做一論述。

1 細胞永生化的概念

細胞永生化（cell immortalization）是目前細胞生物學研究的熱點和難點之一，是指細胞獲得持續生長增殖能力的特性。正常組織來源的細胞，經過有限次的細胞傳代后，會停止增殖，發生衰老和死亡。一般認為永生化是體外培養細胞經過自發的或外界因素的影響從增殖危機中逃逸，從而具有無限增殖能力的過程。細胞自發性永生化的幾率非常小，嚙齒類動物細胞為10－5～10－6，而人類細胞則更罕見，小于10－12。因此，學者們通過基因轉染等技術將外源性永生化基因轉入目的細胞內，以增加永生化的發生幾率，進而建立永生化細胞系［1－2］。

2 細胞永生化的機制

端粒是位于真核細胞線性染色體末端的特殊結構，由一簡單重復的富含堿基G的DNA序列及其相關蛋白組成，國內外研究表明端粒的長度與細胞有絲分裂次數相關，體外培養的細胞每分裂一次，端粒進行性縮短，當縮短到一定程度而不能維護染色體的穩定時，細胞失去分裂增殖的能力，發生衰老。越來越多的例子表明端粒長度控制著衰老的進程，端粒的縮短是觸發衰老的分子鐘。從不同年齡或原代細胞、傳代細胞測定的端粒長度結果都顯示端粒隨年齡或分裂次數增加而縮短，表現為年齡或分裂次數的函數。

端粒酶是一種能延長端粒末端的核糖核蛋白酶，是一種專一的逆轉錄酶，能以自身的RNA為模板，從端粒DNA 3’－OH末端延伸端粒或合成新的端粒DNA，以補償細胞分裂時染色體末端的縮短，從而維持端粒的長度，使細胞不會因端粒耗盡而出現凋亡。因此，端粒酶在保持端粒穩定、基因組完整、細胞長期的活性和潛在的繼續增殖能力等方面有重要作用［3－5］。但是，在正常人體細胞中，端粒酶的活性受到相當嚴密的調控，并不能檢測到端粒酶的活性，只有在造血細胞、干細胞和生殖細胞，這些必須不斷分裂克隆的細胞之中，才可以檢測到具有活性的端粒酶［6－8］。

目前，已經得到實驗研究證實的永生化機制是“端粒假說”理論：正常人或動物原代細胞在體外經過多次分裂后，細胞進入衰老期（senescence，M1期），此時細胞對生長因子等失去反應，產生DNA合成蛋白抑制因子，細胞周期檢查點發送細胞周期停止信號，DNA合成停止，細胞停止分裂開始衰老，但不一定死亡。而病毒、原癌基因和抑癌基因突變體等則可以抑制M1期機制，細胞繞過M1期繼續生長。細胞經過20～30群體倍增次數（population doublings，PDs）后，進入危機期（crisis，M2期），細胞出現退化，如雙著絲粒形成、染色體變短而失穩，分裂細胞逐漸減少，絕大多數細胞發生凋亡，只有罕見的細胞在一些因素影響下，端粒酶被激活，以它自身RNA為模板不斷合成端粒DNA來補充和延長端粒有限長度，以維持端粒長度，恢復染色體的穩定性使細胞得以逾越M2期，細胞就獲得了無限分裂和增殖的能力而成為永生化細胞［2］。

端粒酶逆轉錄酶（telomerase reverse transcriptase，TERT）作為端粒酶的催化亞單位和限速酶，在端粒酶活性維持中起關鍵作用，這就為細胞永生化提供了新的思路。在原代培養的細胞中轉入端粒酶逆轉錄酶（TERT），并穩定表達，能維持端粒的長度，使細胞易于永生化。TERT在進化上相對保守，幾乎所有物種均含有六個逆轉錄酶元件和一個端粒酶特異性元件。目前，研究最多的就是在原代細胞中轉入人端粒酶逆轉錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT），使細胞永生化［9－10］。

3 hTERT永生化細胞的國內外研究現狀

3.1 hTERT永生化細胞的優越性 相對于傳統的永生化基因，即病毒、原癌基因等，hTERT具有許多優越性。首先，hTERT介導的永生化細胞是正常細胞而非轉化細胞。研究表明它們具正常生長率、核型、呈現接觸抑制和錨著依賴性，不具有致癌性和軟瓊脂克隆形成能力等，同時其DNA被紫外線或電離輻射損傷后，P53和P21的反應性誘導與正常細胞相同。當它們處于增殖期時pRb發生過磷酸化，匯合時則發生低磷酸化并下調，而P16INK4a水平則保持穩定，符合正常細胞特征［11］。

3.2 hTERT永生化細胞的研究方法 學者們通常采用基因轉染技術將外源性永生化基因導入目的細胞內，包括電穿孔法、磷酸鈣沉淀法、脂質體轉染法以及逆轉錄病毒和腺病毒介導轉染法。由于表達載體的不同，hTERT導入目的細胞的具體方法不盡相同。有學者構建了兩個真核表達載體pGRN145和pZeoSV－hTERT，采用電穿孔法有效地導入了人視網膜色素上皮細胞和包皮成纖維細胞；若hTERT插入逆轉錄病毒載體如pBabe puro和pBabe hygro，則需要將質粒導入包裝細胞系后產生的病毒上清感染目的細胞；由于電穿孔法需要大量的目的細胞，而逆轉錄病毒介導轉染法雖然效率高但操作較為復雜，近年興起的脂質體介導轉染法因為效率高、操作方便等優點而被廣泛應用，相應的真核表達載體pCI－neo－hTERT也有效應用于脂質體轉染法［12］。

經hTERT永生化的細胞能無限增殖生長，可長期傳代，但并不改變細胞本身的特性，目前主要用以下幾種方法對其進行鑒定：Southern－blot檢測外源基因的整合情況；Western－blot檢測外源基因的表達情況；端粒酶重復擴增PCR方法檢測端粒酶活性；免疫細胞化學技術檢測細胞的特異性抗原；體外及體內法對細胞的致瘤性進行檢測［1］。隨著永生化細胞研究的不斷深入，將有越來越多、更靈敏方便的方法對其進行鑒定。

3.3 hTERT永生化人源細胞的國內外研究進展在人原代細胞的研究上，永生化細胞的研究在國內外都備受親睞。1998年，Bodnar等［13］首先利用外源的hTERT轉染人視網膜色素上皮細胞和包皮成纖維細胞，結果細胞分裂旺盛，細胞壽命延長了至少20PDs。后續研究發現，此類細胞可持續增殖，至少達未轉染細胞PDs的2－3倍。美國Clontech公司與Geron公司轉染hTERT至人視網膜色素上皮細胞，合作推出第一種商品化的永生化正常細胞系hTERT－RPE1，其較正常細胞增殖快，平均每周達5－6PDs，有3個克隆傳代多于300代［14］。Wang J等［15］用正常的人乳腺上皮細胞轉染hTERT后，細胞壽命超過了未轉染對照組細胞壽命的40PDs。Wieser等［16］的研究結果表明，外源表達hTERT足以使腎近端小管上皮細胞永生化，永生化細胞的各項表型與原代細胞一致，經過連續90次群體倍增后，轉化細胞依然保持良好的遺傳穩定性。全球最大的生物材料資源中心美國典型培養物保藏中心（ATCC）也致力于人類細胞的hTERT永生化細胞系的構建，目前已構建了10余種hTERT永生化細胞系，并實現了商品化，一些永生化的細胞在臨床上已經得到了應用，如細胞治療和構建工程化組織等［17－19］。國內劉官智等［20］采用脂質體轉染法，將hTERT基因導入人毛乳頭細胞中，已連續傳至65代，且具有正常細胞的生物學特征；高雯等［21］通過端粒酶導入技術成功構建永生化人輸卵管上皮細胞；陳之峰等［22］利用反轉錄病毒載體將hTERT基因轉入口腔黏膜上皮細胞，進行一系列檢測后顯示，轉染細胞增殖活躍，群體倍增數超過80，hTERT基因在轉染細胞中穩定表達，而在未轉染細胞中不表達。永生化獲得成功的報道還有人肺成纖維細胞、皮膚成纖維細胞、人臍靜脈血管內皮細胞等等。

3.4 hTERT永生化動物源細胞國內外研究進展近年來，動物源細胞永生化的研究也取得了很大的進展。Sabine等［23］采用hTERT基因轉染技術，獲得了永生化的豬輸卵管上皮細胞系，該細胞具有端粒酶活性，并與上皮細胞標志物角蛋白具有免疫反應；Sungwook［24］用轉染端粒酶hTERT和猿猴病毒SV40LT兩種方法，成功建立了豬腎永生化細胞系，并傳至30代，發現兩種方法獲得的細胞在軟瓊脂上均不生長，在10%FBS－DMEM培養基中增殖能力明顯快于原代細胞，為病毒研究提供了很好的細胞來源；Sagong等［25］采用反轉錄病毒介導的基因轉染系統，將hTERT cDNA轉染豬肺泡巨噬細胞，穩定轉染細胞能表達hTERT基因，使細胞永生化，該永生化細胞未影響細胞表面CD163受體的表達水平，對美洲型和歐洲型PRRSV毒株均高度易感。國內研究者在動物細胞永生化方面也做了一些研究，方澤強［26］等2003年采用新西蘭大白兔的顳頷關節表面軟骨組織進行的hTERT轉染實驗結果證實：轉染hTERT的軟骨細胞內可檢測到明顯的端粒酶活性，且具有較為旺盛的分裂能力，傳至100代后細胞仍可以增殖，除細胞體積有縮小外，其他生物學特性基本正常，未經轉染hTERT的對照組軟骨細胞未檢測到端粒酶活性，傳至第8代已經停止分裂；洪海霞等［37］將編碼hTERT和neo基因的真核表達質粒pCI－neo－hTERT導入原代培養的豬臍靜脈血管內皮細胞，激活了其端粒酶活性，延長了細胞在體外培養的壽命，獲得了永生化豬臍靜脈血管內皮細胞并傳至56代，且該細胞仍保持其正常的生物學特性和分泌功能，隨后，該研究小組將CSFV E2基因導入豬臍靜脈血管內皮細胞獲得表達，而且成功誘導小鼠產生抗E2蛋白的抗體［28］；李吉霞等［29］轉染hTERT基因成功建立永生化牛乳腺上皮細胞，轉染后的細胞形態正常、生長活力旺盛、核型正常、無致瘤性，且有端粒酶活性，已成功傳至68代，隨之將該細胞作為供核細胞，初步運用于核移植的研究；曹暉等［30］從2.5～3月齡胎豬胰腺組織中分離出間充質干細胞，轉染hTERTJ基因永生化胎豬胰腺源間充質干細胞，具有很強的體外增殖能力，體外能夠分化為其他類型細胞，可為組織工程和再生醫學的研究提供足夠的細胞資源。

4 hTERT永生化細胞的應用前景

針對疫病的防控，我國主要采取以疫苗免疫接種為主的綜合性防治措施，疫苗發展主要經歷了組織苗、原代細胞苗和傳代細胞苗的過程。組織苗使用活體動物生產，生產量有限且成本高；原代細胞苗在制備工藝上雖然優于組織苗，但卻存在原代細胞傳代次數有限、不同批次細胞質量和敏感性有差異、易造成外源病毒污染等問題，阻礙了其在疫苗上的進一步發展。為了克服組織苗和原代細胞苗的缺陷，研究者們用傳代細胞適應病毒增殖并獲得成功，從而使疫苗的生產更簡單、快速，同時也使疫苗的生產更標準化、低成本和規模化，使疫苗生產在生物反應器上批量工廠化生產變為現實，從而大大優化了疫苗生產工藝、提高了病毒滴度。可以說，傳代細胞系的使用給疫苗的生產帶來了突破性的進展。但傳代細胞系的使用也有其局限性，特別是其運用于活疫苗生產時，其株系特性，特別是有無致瘤性，不僅直接影響到疫苗的質量而且關系到人畜的健康與安全。致癌基因模型的風險性評估顯示，體內基因組中含有某一具有活性的致癌基因100拷貝即可引起1／109個受體發生轉化。因此，研究認為，當細胞殘留DNA高于100pg／劑量時，細胞DNA潛在的風險將不容忽視［31］。若用致瘤性細胞系生產疫苗，疫苗癌基因會隨活苗接種而整合入體內，人類若接種有癌基因的疫苗或長期食用整合有癌基因的肉類，有可能出現新一代癌癥，釀成新的公共衛生問題。國外及中國藥典對傳代細胞系用于疫苗生產的傳代代次、DNA殘留量都有嚴格的控制［32－33］。而永生化的細胞克服了原代細胞和傳代細胞系的缺陷，具有原代細胞生物學特性，又兼具傳代細胞系均一、穩定、操作簡單且能長期傳代培養的特性，在疫苗的生產上將是較好的候選細胞。

來源于靶宿主組織的細胞，是病毒增殖的理想工具。目前，應用于病毒性疾病研究的細胞較少，特別是在動物醫學研究上，而且每種病毒能增殖的細胞有限，細胞系的相對缺乏影響了病毒學研究的發展。永生化細胞，具有原代細胞的生物學特性，這就為病毒性疾病的研究提供了很好的感染模型，為研究病毒生長、增殖、代謝規律及與細胞的相互作用提供了優良的細胞基質。

在體外延長細胞壽命在研究生長和分化的生理生化特征方面，克隆的永生化細胞比已經建立的腫瘤細胞系具有更大的優勢，因為它更能代表機體內的正常生理狀態，有助于研究器官衰老現象發生的機制，為我們攻克腫瘤，研究干細胞的特性，控制細胞的增殖分化等許多方面的研究奠定堅實的基礎。同時永生化在體外可多次傳代，具有相對穩定的增殖特性和功能狀態，將其作為細胞工程和組織工程等研究領域的標準細胞，有助于體外實驗的標準化。永生化細胞也可作為體內治療的載體，長期而穩定地發揮我們所要求的療效，而不會引起不良反應，現已有人將永生化細胞應用于臨床研究。

5 展望

從上個世紀末至今，hTERT永生化細胞的研究不過短短二十幾年的時間，就已經取得了令人矚目的成就，利用hTERT構建的永生化細胞系也已經在基礎研究及醫學領域中發揮了初步作用，并顯現出很好的應用前景。但同時這個新興的領域還有很多未知的東西需要我們和后來的人們去逐一破解，比如hTERT的分子調控機制、永生化和腫瘤細胞的關系、永生化細胞的局限性、對不同細胞采用何種永生化方法等。總之，永生化細胞的研究是困難與機遇并存、問題與結果碰撞的起步階段，隨著技術的完善和研究的深入，相信永生化細胞將在細胞學及醫學領域發揮重要作用。

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（編輯：陳希）

The Research Progress and Application Prospect of Immortalized Cell by hTERT

ZHANG Min，CHEN Xiao－yun，WANG Lei，WANG Dong，JIANG Tao－zhen，WANG Jing－wen
（Chine Institute of Veterinery Drug Control，Beijing 100081，China）

Immortalized cells induced by human telomerase reverse transcriptase（hTERT）are ideal cell source for their biological specificity of primary cell line and infinite proliferative capacity of passage cell line.They have shown superior advantage in fundamental research，clinical application and bioengineering.In this review，we introduced research progress and application prospect of immortalized cells induced by hTERT.

immortalization；telomere；telomerase；human telomerase reverse transcriptase（hTERT）

2015－01－06

A

1002－1280（2015）02－0058－05

Q28

張敏，碩士，從事動物細胞與病毒學方面研究。E－mail：zmbooksea＠163.com