MDR1基因C3435T多態性對彌漫性大B細胞淋巴瘤化療效果及血液學毒性的影響▲

黃谷瑜 柯 晴 譚曉虹 岑 洪

(廣西醫科大學附屬腫瘤醫院化療三科，南寧市 530021，E－mail:hgy420@qq．com)

彌漫性大B細胞淋巴瘤(diffuse large B－cell lymphoma，DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤最常見的類型，是一組在臨床特征、預后等方面具有高度異質性的腫瘤［1］。人類多藥耐藥基因1(multidrug resistance 1，MDR1)的產物P－糖蛋白(P－glycoprotein，P－gp)是一種 ATP 依賴性轉運蛋白，能將許多結構不同的化合物逆向轉運出細胞。MDR1 C3435T(rs1045642)位于26號外顯子，可影響P－gp的表達和活性［2］。腫瘤細胞產生的MDR1基因過表達是導致化療失敗的一個主要因素［3］。目前許多研究已證實MDR1基因C3435T多態性與多種腫瘤的預后及化療相關毒性有關。本研究旨在探討MDR1基因C3435T多態性對DLBCL患者的化療療效及化療相關血液學毒性的影響。

1 資料與方法

1．1 臨床資料 選擇2008年1月至2013年12月在廣西醫科大學附屬腫瘤醫院初治的DLBCL患者117例，診斷均符合WHO 診斷標準［4］，臨床分期采用Ann－Arbor分期，患者均接受4周期以上的CHOP(環磷酰胺、長春新堿、阿霉素、潑尼松)方案或R－CHOP(利妥昔單抗、環磷酰胺、長春新堿、阿霉素、潑尼松)方案一線化療。117例患者中，116例有完整的血液學毒性資料，109例有一線化療療效評價資料，99例有詳細的隨訪資料。患者臨床資料見表1。

1．2 儀器和試劑 基因組DNA提取試劑盒TIANamp購自北京天根公司;PCR擴增引物由上海英駿生物技術有限公司合成;PCR擴增試劑盒Premix Ex Taq及限制性內切酶MboI購自大連TaKaRa公司;PCR擴增儀Biometra Tprofessional購自德國Biometra公司;核酸染料GelRed購自美國Biotium公司;凝膠成像系統購自美國Bio－Rad公司。1．3 MDR1基因C3435T多態性檢測 采用聚合酶鏈式反應－限制性片段長度多態性(PCR－RFLP)方法對多態性進行分析。抽取患者外周靜脈血2 ml，用乙二胺四乙酸(EDTA)管抗凝，參照DNA提取試劑盒說明書分離基因組DNA。PCR 引 物 序 列 為 5'－TTGATGGCAAAGAAATAAAGC－3'和 5'－CTTACATTAGGCAGTGACTCG－3'。PCR 反應體系是 25 μl:0．3 μg 基因組 DNA、上下游引物各0．3 μm、Premix Ex Taq 12．5 μl;反應條件是:98℃ 變性10 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，重復30 個循環。PCR擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳、用GelRed染色，在紫外線下觀察，DNA條帶為包含MDR1基因C3435T多態性位點的208 bp 的片段。酶切體系是 20 μl:1 μl MboI、2 μl PCR產物、1 μl 10×K緩沖液;反應條件是37℃消化2 h。酶切產物用上述方法觀察DNA條帶。TT純合基因型可觀察到1條未消化的條帶(208 bp)，CT雜合基因型可觀察到208 bp、145 bp和63 bp 3條帶，CC純合基因型可觀察到145 bp和63 bp 2條帶。選擇部分PCR產物進行DNA測序驗證其分型結果。

1．4 治療方法 117例 DLBCL患者均采用一線的CHOP方案或R－CHOP方案化療，21 d為1周期，中位化療周期為6(4～8)周期。在治療期間每2周期進行療效評價，治療結束后2年內每3個月進行療效評價，治療結束后3～5年每6個月評價療效(對于入組較晚的患者，以最后一次隨訪結果進行分析)。

1．5 療效評價、生存分析及血液學毒性評價 療效評價參照非霍奇金淋巴瘤NCCN指南2012年第3版淋巴瘤緩解標準［5］，分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、疾病穩定(SD)和疾病進展(PD)。總緩解率(ORR)為CR率和PR率之和。無進展生存(PFS):是指從治療開始到疾病進展、復發，或者死亡的時間。總生存(OS):是

指從治療開始到任何原因引起死亡的時間。血液學毒性評價參照WHO抗癌藥急性及亞急性毒性分級標準［6］。嚴重的血液學毒性包括Ⅲ～Ⅳ級的白細胞減少、血小板減少以及貧血。

1．6 統計學分析 使用IBM SPSS 22．0統計軟件進行分析。計數資料采用秩和檢驗或χ2檢驗(或Fisher精確概率法)。生存分析采用 Kaplan－Meier法，用Breslow(Generalized Wilcoxon)檢驗比較PFS和OS有無統計學差異。以P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 MDR1 C3435T等位基因的頻率 在117例DLBCL患者中，CC基因型47例(40．2%，47/117)，TT基因型17例(14．5%，17/117)，CT 基因型 53 例(45．3%，53/117)，C和T等位基因頻率分別是62．8%(147/234)和37．2%(87/234)。117例DLCBL患者的MDR1 C3435T的基因型分布符合Hardy－Weinberg平衡(P=0．743)。

2．2 MDR1 C3435T不同基因型患者的臨床資料比較

117例患者中，CC基因型47例，CT+TT基因型70例，CC基因型組與CT+TT基因型組患者性別、年齡、臨床分期、血清乳酸脫氫酶水平、結外器官侵犯數目、體能狀況評分和國際預后指數評分、化療方案比較，差異無統計學意義(P均＞0．05)，具有可比性。

表1 CC基因型組與CT+TT基因型組患者臨床資料比較(n，%)

2．3 MDR1 C3435T不同基因型組患者的療效比較 117例患者中，109例患者有一線化療療效評價資料，其中CC基因型44例，CT+TT基因型65例。治療后，CT+TT基因型組患者的ORR、CR率稍高于CC基因型組，但兩組比較，差異無統計學意義(u=1．129，P=0．129)。見表2。

表2 不同基因組患者臨床療效比較(n，%)

2．4 MDR1 C3435T不同基因型組患者的生存時間比較

117例患者中，99例患者有完整隨訪資料，中位隨訪時間為11．2月。99例患者中，CC基因型38例，CT+TT基因型61例。CT+TT基因型組患者的中位PFS時間為29．6個月，明顯長于CC基因型組患者的17．7個月(χ2=5．363，P=0．021)，見圖 1。而兩組患者 OS 比較，差異無統計學意義(χ2=0．005，P=0．942)，見圖 2。

圖1MDR1 C3435T各基因型DLBCL患者PFS曲線比較

圖2 MDR1 C3435T各基因型DLBCL患者OS曲線比較

2．5 MDR1 C3435T不同基因型組患者的血液學毒性比較 116例有完整的血液學毒性資料患者中，CC基因型46例，CT+TT基因型70例。經化療后，CT+TT基因型組嚴重貧血、血小板減少和嚴重血小板減少發生率明顯低于CC基因型組患者(P＜0．05)。見表3。

表3 MDR1 C3435T不同基因型患者血液學毒性比較(n，%)

3 討論

近年來，隨著靶向藥物的開發、應用以及化療方案的不斷完善，DLBCL患者的療效及預后大大提高。R－CHOP方案已確定為 DLBCL患者的標準治療方案［7］。盡管使用標準治療方案，但仍有1/3的DLBCL患者最終發展為復發/難治性淋巴瘤［8］。

P－gp是MDR1基因的蛋白產物，又稱ATP結合盒式轉運子，具有廣泛的底物特異性，可轉運多種化學成分，包括外源性物質(如抗腫瘤藥物和細菌毒素)以及內源性復合物，因此它可以保護機體不受侵害［9］。DLBCL化療方案中的主要藥物長春新堿和阿霉素，則是P－gp的底物。

MDR1基因C3435T多態性是一種同義突變的單核苷酸多態性，即不產生編碼序列的改變。以往認為MDR1基因C3435T同義突變是沉默的突變，但目前研究證實MDR1基因同義突變可能會影響其產物P－gp的表達及功能［10］。但尚不明確這種基因突變是否會影響化療的療效和毒性。Hoffmeyer等［2］對高加索人群十二指腸中P－gp的表達水平與MDR1基因C3435T多態性的關系進行統計分析，結果發現CC型患者MDR1表達水平比TT型患者高2倍，并且TT型患者血漿藥物含量最高。Illmer等［11］研究也證實，MDR1基因C3435T多態性可通過選擇性藥物轉運等特殊機制影響急性髓細胞白血病患者的治療效果，并且CC型基因可能是疾病復發的獨立影響因素。Jamroziak等［12］報告慢性淋巴細胞白血病患者細胞中P－gp的活性由MDR1 C3435T基因型決定，CC基因型患者P－gp活性最高，TT基因型最低，而P－gp對抗癌藥物轉運起重要作用，因此MDR1可影響化療療效。關于急性淋巴細胞白血病、多發性骨髓瘤和乳腺癌的研究，也證實T攜帶者的OR率或OS優于CC型患者［13－15］。然而，有一些研究得出不同的結論，如 Hu等［16］對中國DLBCL患者的研究結果表明，TT基因型患者的OS較短;Cizmarikova等［17］發現在基于蒽環類藥物化療的乳腺癌患者中，CC基因型患者的PFS和OS更長;還有研究證實MDR1基因mRNA的表達量在T基因攜帶者中比 C基因攜帶者高［18］，或認為 MDR1基因C3435T多態性與急性髓細胞白血病患者的療效和預后無相關性［19－20］。

本研究結果顯示，MDR1基因 C3435T多態性與DLBCL患者的PFS和化療后血液學毒性有關聯，CT+TT基因型患者較CC基因型患者PFS長，嚴重貧血、血小板減少和嚴重血小板減少的發生率低(P＜0．05)。本研究結果與部分學者的研究結果有所不同，如Erdelyi等［21］的研究發現TT基因型患者化療后更易于合并感染，但各基因型患者化療后嚴重白細胞減少發生率無差異;Tran等［22］報告，TT基因型患者化療后更易發生嚴重血液學毒性。還有的學者認為MDR1基因C3435T多態性與化療后血液學毒性發生無顯著相關性［17，23］。造成這些研究結果差異的原因還不清楚，推測可能與研究對象種族、腫瘤病理類型、治療方案等因素有關。此外，上述研究大多是回顧性研究，研究的樣本量相對較小、隨訪時間相對較短，不足以達到充分的檢驗效能。因此要得到明確結論，尚需前瞻性大樣本的研究進一步證實。

綜上所述，MDR1基因 C3435T多態性可能影響DLBCL患者的化療效果和血液學毒性。未來可通過研發靶向MDR1的藥物，減少腫瘤細胞耐藥發生，進而提高DLBCL患者化療效果、減輕化療藥物毒性反應，最終實現基于基因多態性的個體化治療。

［1］ Lenz G，Staudt LM．Aggressive lymphomas［J］．N Engl J Med，2010，362(15):1 417 －1 429．

［2］ Hoffmeyer S，Burk O，von Richter O，et al．Functional polymorphisms of the human multidrug－resistance gene:multiple sequence variations and correlation of one allele with P－glycoprotein expression and activity in vivo［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2000，97(7):3 473 －3 478．

［3］ Fung KL，Gottesman MM．A synonymous polymorphism in a common MDR1(ABCB1)haplotype shapes protein function［J］．Biochim Biophys Acta，2009，1794(5):860 －871．

［4］ A clinical evaluation of the International Lymphoma Study Group classification of non－Hodgkin's lymphoma．The Non－Hodgkin's Lymphoma Classification Project［J］．Blood，1997，89(11):3 909 －3 918．

［5］ Cheson BD，Pfistner B，Juweid ME，et al．Revised response criteria for malignant lymphoma［J］．Clin Oncol，2007，25(5):579－586．

［6］ Miller AB，Hoogstraten B，Staquet M，et al．Reporting results of cancer treatment［J］．Cancer，1981，47(1):207 － 214．

［7］ Coiffier B，Lepage E，Briere J，et al．CHOP chemotherapy plus rituximab compared with CHOP alone in elderly patients with diffuse large－B－cell lymphoma［J］．N Engl J Med，2002，346(4):235 －242．

［8］ Friedberg JW．New strategies in diffuse large B－cell lymphoma:translating findings from gene expression analyses into clinical practice［J］．Clin Cancer Res，2011，17(19):6 112－6 117．

［9］ Shankland KR，Armitage JO，Hancock BW．Non－Hodgkin lymphoma［J］．Lancet，2012，380(9 844):848 －857．

［10］ Kimchi－Sarfaty C，Oh JM，Kim IW，et al．A"silent"polymorphism in the MDR1 gene changes substrate specificity［J］．Science，2007，315(5811):525 －528．

［11］ Illmer T，Schuler US，Thiede C，et al．MDR1 gene polymorphisms affect therapy outcome in acute myeloid leukemia patients［J］．Cancer Res，2002，62(17):4 955 －4 962．

［12］ Jamroziak K，Balcerczak E，Smolewski P，et al．MDR1(ABCB1)gene polymorphism C3435T is associated with P－glycoprotein activity in B－cell chronic lymphocytic leukemia［J］．Pharmacol Rep，2006，58(5):720 －728．

［13］ Jamroziak K，Mlynarski W，Balcerczak E，et al．Functional C3435T polymorphism of MDR1 gene:an impact on genetic susceptibility and clinical outcome of childhood acute lymphoblastic leukemia［J］．E Eur J Haematol，2004，72(5):314－321．

［14］ Buda G，Maggini V，Galimberti S，et al．MDR1 polymorphism influences the outcome of multiple myeloma patients［J］．Br J Haematol，2007，137(5):454 －456．

［15］ George J，Dharanipragada K，Krishnamachari S，et al．A single－nucleotide polymorphism in the MDR1 gene as a predictor of response to neoadjuvant chemotherapy in breast cancer［J］．Clin Breast Cancer，2009，9(3):161 －165．

［16］ Hu LL，Yu B，Yang J．MDR1 polymorphisms associated with risk and survival in diffuse large B－cell lymphoma［J］．Leuk Lymphoma，2013，54(6):1 188 －1 193．

［17］ Cizmarikova M，Wagnerova M，Schonova L，et al．MDR1(C3435T)polymorphism:relation to the risk of breast cancer and therapeutic outcome［J］．Pharmacogenomics J，2010，10(1):62－69．

［18］ Nakamura T，Sakaeda T，Horinouchi M，et al．Effect of the mutation(C3435T)at exon 26 of the MDR1 gene on expression level of MDR1 messenger ribonucleic acid in duodenal enterocytes of healthy Japanese subjects［J］．Clin Pharmacol Ther，2002，71(4):297 －303．

［19］ Hur EH，Lee JH，Lee MJ，et al．C3435T polymorphism of the MDR1 gene is not associated with P－glycoprotein function of leukemic blasts and clinical outcome in patients with acute myeloid leukemia［J］．Leuk Res，2008，32(10):1 601 － 1 604．

［20］ van der Holt B，Van den Heuvel－Eibrink MM，Van Schaik RH，et al．ABCB1 gene polymorphisms are not associated with treatment outcome in elderly acute myeloid leukemia patients［J］．Clin Pharmacol Ther，2006，80(5):427 －439．

［21］ Erdélyi DJ，Kámory E，Zalka A，et al．The role of ABC－transporter gene polymorphisms in chemotherapy induced immunosuppression，a retrospective study in childhood acute lymphoblastic leukaemia［J］．Cell Immunol，2006，244(2):121－124．

［22］ Tran A，Jullien V，Alexandre J，et al．Pharmacokinetics and toxicity of docetaxel:role of CYP3A，MDR1，and GST polymorphisms［J］．ClinPharmacolTher，2006，79(6):570－580．

［23］ Chang H，Rha SY，Jeung HC，et al．Association of the ABCB1 3435C＞T polymorphism and treatment outcomes in advanced gastric cancer patients treated with paclitaxel－based chemotherapy［J］．Oncol Rep，2010，23(1):271 －278．