生鮮牛乳中產Nisin菌株的篩選

□ 解曉靜

一、引言

(一)天然防腐劑Nisin。

1．Nisin的作用機理。Nisin是由乳酸乳球菌乳酸亞種菌株產生的一種肽類細菌素，首次發現于1928年，Nisin與敏感菌細胞膜膜脂相互作用，通過結合、插入、孔道形成等多步過程形成孔道復合物，從而導致細胞內溶質(氨基酸、核酸、ATP等)的迅速流失、質子動力勢的耗散，抑制細胞的生物合成(尤其是肽聚糖的合成)途徑，直接或者通過對其他細胞毒素的敏化作用引起細胞的死亡。

2．Nisin的抑菌譜。Nisin的抑菌譜為G+菌;對于G—細菌沒有作用，但膜干擾劑(EDTA、檸檬酸鹽、磷酸鈉等)或者亞致死傷害因素(加熱、冷凍、超高壓和脈沖電場等)會改變G—菌外膜對Nisin的通透性，使G—細菌變得敏感;此外，Nisin與一些天然成分和其他防腐劑組合使用時具有增益效應，從而改善其抗菌譜、增強抗菌效果。

(二)Nisin在食品防腐上的應用。

1．Nisin使用的安全性。對于Nisin，人們在食用乳制品時往往是無意攝入。由于Nisin是乳酸鏈球菌的天然產物，再加上迄今為止沒有發現過中毒或者副作用的相關案例。所以很多人認為它是無毒的，雖然沒有相關案例也并不能說明它的無毒，攝入量等方面都是其安全性的主要因素。研究發現乳酸鏈球菌素不會與其他抗菌素產生抗性，可以配合使用。在腸胃中，乳酸鏈球菌素能被蛋白質水解酶降解而迅速失活，食用含Nisin的液體10 min之后，在人體唾液中檢測不出Nisin，不存在干涉腸道有益微生物的正常構成。目前對乳酸鏈球菌素已進行的毒性和生物學研究包括致癌性、腎功能、腦功能等，都證明乳酸鏈球菌素對人體無毒，因而被認為是安全的防腐劑。

2．Nisin在食品防腐應用上的廣泛性。Nisin最早用于干酪的防腐，隨后又成功應用于全脂消毒牛乳、滅菌乳、風味乳等各種乳制品的防腐保鮮。在肉制品中，其也有大量廣泛的運用，最常見的如火腿、罐頭等，不僅可以延長保存期，也可以改善食品外觀，另外可以去掉或者降低亞硝酸鹽的使用。

二、材料與方法

(一)試驗材料。

1．菌種。金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus):由微生物實驗室提供。

2．主要培養基。富集乳酸菌培養基(脫脂乳培養基):將生牛乳煮沸10至20分鐘，隔夜冷卻，去掉上層脂肪。乳酸乳球菌試管斜面及發酵培養基(M17G培養基):蛋白胨1%，牛肉膏0．5%，酵母膏 0．25%，抗壞血酸 0．05%，硫酸鎂 0．025%，甘油1%，磷酸二氫鉀0．5%，乳糖0．3%，固體培養基中加入1．5%瓊脂。分離培養基(M17培養基):蛋白胨1%，牛肉膏0．5%，酵母膏0．25%，抗壞血酸0．05%，硫酸鎂0．025%，甘油1%，磷酸二氫鉀0．5%，以蔗糖(1%)作碳源，同時含有0．004%溴甲酚紫。

(二)實驗儀器。生化培養箱;高速離心機;高壓蒸汽滅菌鍋;電子天平;水浴鍋等。

(三)主要試劑。包括蛋白胨，酵母膏，牛肉膏，抗壞血酸，MgSO4，KH2PO4，溴甲酚紫，蔗糖，乳糖，丙三醇等。

(四)實驗方法。

1．乳酸鏈球菌的富集培養。取生牛乳5mL加入到100ml脫脂乳培養基中富集培養，28℃培養24h。按1%接種量吸取上述脫脂乳培養液1mL，加入到M17G液體培養基中，28℃培養24h。

2．指示菌懸液的制備。取金黃色葡萄球菌斜面一支，用接種針挑取少量菌種接種于營養肉湯液體培養基中，37℃發酵培養24h。得到的培養液作為原液，將原液稀釋至10－1稀釋度，備用。

3．乳酸鏈球菌素產生菌的篩選。把M17G液體培養物制成10－4、10－5、10－6稀釋度的菌懸液，分別吸取0．1mL 放入M17分離培養基上，涂布，28℃培養24h，挑取單菌落，在分離培養基上劃線，反復3次。

4．發酵液預處理。將劃線得到的單菌落接種于M17G液體培養基中，28℃發酵培養24h。發酵液用2mol/L的HCl調整 pH 值至 2．5，然后在 90℃ 加熱 30min，3，500r/min 離心20min，去除菌體收集上清液。

5．抑菌活性檢測。于超凈工作臺上將配好的肉湯營養瓊脂培養基倒入內徑為90mm，高16mm～17mm的平皿內。適當增加培養基的厚度以備打孔。待凝固后倒入150μL指示菌懸液，涂布使其分布均勻。待菌懸液被吸收晾干后，用打孔器在營養瓊脂培養基上打孔，直徑為7mm，孔間距應足夠大，以免抑菌圈重疊。注意打孔時不要將培養基打透。5min后向孔中滴加處理后的發酵上清液100μL，小心放入培養箱，28℃培養48h后觀察抑菌圈直徑大小。

三、結果與分析

(一)乳酸鏈球菌素產生菌的平板篩選。在蔗糖作碳源的M17培養基上，配以溴甲酚紫作指示劑進行乳酸鏈球菌素產生菌的平板篩選。如果一個菌株能在高濃度的蔗糖培養基上生長，表明該菌種具有較好的抗滲透作用，有可能是革蘭氏陽性菌。如果該菌落周圍的培養基由紫色轉變為黃色，表明該菌落在代謝過程中分泌了酸性物質，從而改變了培養基的pH(見圖1)。選擇同時具備上述兩個特征的菌落進行抑菌圈測定試驗，分離到三株對金黃色葡萄球菌有明顯抑制作用的菌株(見圖2)。

圖1 使M17培養基變黃的乳酸菌

圖2 三株乳酸菌對金黃色葡萄球菌的抑制作用

(二)候選菌株顯微鏡觀察鑒定。觀察上述三株菌落，乳白色，隆起，外形光滑，濕潤;在顯微鏡下觀察，細胞球形，呈鏈狀出現，革蘭陽性，無芽孢，不運動。

四、結論

實驗中得到了具有抗滲透且能分泌酸性物質的三株候選菌，抑菌圈試驗證明其發酵液上清具有抗革蘭氏陽性菌生物活性，經顯微鏡觀察菌體形態與乳酸乳鏈球菌基本一致，故初步認定本實驗篩選出三株產乳酸乳鏈球菌素的候選菌株。

五、創新之處

第一，從生鮮牛乳中分離乳酸乳鏈球菌，用脫脂乳培養基做富集培養。第二，以金黃色葡萄球菌做指示菌，觀察抑菌效果。第三，參考文獻中分離培養基中加入了50IU/mL過濾除菌的乳鏈菌肽。本實驗中沒有添加乳鏈菌肽。但是也分離得到了使M17培養基變黃的乳酸菌。顯微鏡下其菌落形態符合要求。

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