開菲爾粒中優勢乳酸菌的分離篩選與鑒定

□ 王 華 薛玉玲 馮麗莉 王世杰 朱 宏

開菲爾是以牛奶、羊奶為原料，用開菲爾粒作為發酵劑而制得的一種含醇、酸及少量二氧化碳的發酵乳，又稱牛奶酒。開菲爾粒可用于家庭或工業化的開菲爾生產，它起源于俄羅斯北高加索地區，在古時當地的山岳牧民將牛乳或山羊乳注入羊皮口袋經自然發酵生產酸乳酒，其殘留物再補加牛乳或山羊乳繼續發酵，經長期發酵后在皮口袋中形成不規則顆粒狀物體，即為開菲爾粒。開菲爾乳具有眾多生理功能，Koroleva等研究認為開菲爾具有較高的營養價值和保健功效，可以抑制血壓上升、預防心臟病、降低血清中膽固醇水平、預防胃腸道疾病等;Grag等認為一般酸奶中由于乳酸菌代謝消耗VB族，從而使酸奶中維生素含量下降，而開菲爾中VB含量明顯提高。有人研究表明開菲爾中含有琥珀酸等四碳雙羧酸，在機體內具有溶解癌細胞的作用;而最有價值的是開菲爾中含有0．2% ～0．7%的開菲爾多糖，這些多糖具有抗腫瘤、提高機體免疫等多種生物活性。然而，由于開菲爾本身所具有的特殊風味，不能很好地適應東方人的口味。因此，從開菲爾粒中篩選具有益生特性的乳酸菌具有非常重要的意義。

一、材料與方法

(一)實驗材料。開菲爾粒:來源于波蘭卡利什;培養基:含溴甲酚紫的MRS固體培養基;30%雙氧水:天津市東方化工廠;糖發酵管:北京陸橋技術有限責任公司;DNA試劑盒及PCR試劑:天根生化科技有限公司。

(二)實驗儀器。顯微鏡:奧斯巴林有限公司;生化培養箱:上海新苗醫療器械制造有限公司;電泳儀及電泳槽:北京六一儀器廠;超凈臺:上海新苗醫療器械制造有限公司;PCR儀:杭州博日科技有限公司;凝膠成像系統:北京六一儀器廠。

(三)試驗方法。

1．乳酸菌的分離與純化。將開菲爾粒在脫脂奶中活化3代后，取開菲爾粒1g，用滅菌生理鹽水洗滌后，在滅菌的研缽中研磨成漿，加入9ml生理鹽水進行稀釋，取1ml稀釋液進行適當稀釋，將104、105、106稀釋度涂布溴甲酚紫 －MRS瓊脂平板。

取開菲爾粒發酵乳1ml，用生理鹽水進行適當稀釋，取106、107、108稀釋度涂布溴甲酚紫－MRS瓊脂平板。

上述平板置于37℃厭氧培養72h。取上述平板生長良好，具有典型菌落形態并出現顏色變化的菌落進行劃線分離，在需氧條件下反復純化3次。經革蘭氏染色和接觸酶反應，挑出革蘭氏陽性、接觸酶陰性的菌株進行保存備用。

2．乳酸菌的分離和鑒定。

(1)形態學鑒定。將分離純化的菌株分別涂布到MRS平板培養基上，37℃培養48h～72h，取典型菌落進行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察菌落形態。

(2)生理生化鑒定。將分離純化的菌株分別進行葡萄糖產氣試驗，糖發酵管試驗。

(3)分子生物學鑒定。將分離純化的菌株進行DNA提取，16S rDNA PCR擴增，引物為:27F 5’－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG －3’，1492R5’－TACGGCTACCTTGTTACG ACTT－3’。PCR擴增片段為1500bp。反應后將樣品進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，為陽性者送由華大基因進行測序，通過測序結果對篩選菌株進行分類。

二、結果與分析

表1 開菲爾粒中乳酸菌分離株的基本形態和特征

(一)菌株分離結果。從開菲爾粒中共分離得到一株乳酸桿菌和一株鏈球菌，并將其分別命名為KL22、KV30。通過染色鏡檢、過氧化氫酶試驗、產酸產氣試驗，可以得知表1是從開菲爾粒中分離出的乳酸菌菌株的形態特征及部分理化特征。

(二)初篩結果。由于《可應用于食品的菌種名單》和《可用于保健食品的益生菌菌種名單》中大部分菌株均為桿菌，球菌只有嗜熱鏈球菌一種，本次試驗目的主要為篩選可食用的菌株，因此我們對上述桿菌進行了糖發酵試驗，試驗結果如表2所示。

表2 KL22菌株糖發酵結果

從表2中可以看出，通過糖發酵實驗結果與《常見細菌系統鑒定手冊》(科學出版社，2001年)中乳桿菌的鑒別特征進行對比，不能確定上述菌株的分子生物學分類，因此又對兩株菌進行了分子生物學鑒定。

(三)乳酸菌分子生物學鑒定。我們對上述2株乳酸菌進行DNA提取及16S rDNA序列擴增，并對擴增片段進行電泳，從電泳圖中我們可以看出目的片段大小正確，條帶清晰，可用于后續的16S rDNA測序。

圖1 菌株KL22的16S rDNA序列的系統發育樹

圖2 菌株KV30的16S rDNA序列的系統發育樹

隨后我們將上述2株疑似乳酸菌16S rDNA序列送至華大基因進行測序，并在 NCBI網站上利用 BLAST(http://www．ncbi．nlm．nih．gov/BLAST)對所測菌株的 16S rDNA 序列與GenBank數據庫中已知細菌的16S rDNA序列進行比較鑒定，尋找與目的基因序列同源性最高的已知分類地位的菌種，同時以非同屬的模式菌株為外標，利用MEGA4軟件繪制出系統發育樹，由圖1可知KL22與Lactobacilus kefiri strain NM180－3的親緣關系最近，序列相似度為99%，因此將該菌株確定為開菲爾乳桿菌;由圖2可知KV30與Streptococcus thermophilus親緣關系最近，序列相似度為100%，因此將該菌株確定為嗜熱鏈球菌。

三、結語

由于開菲爾粒中微生物分布的不均勻性，為盡可能多地分離其中的乳酸菌，本實驗分別從開菲爾粒和開菲爾發酵液進行乳酸菌的篩選，并將開菲爾粒中篩選的乳酸菌命名為KL22，將開菲爾發酵液中篩選的乳酸菌命名為KV30。

通常開菲爾中乳桿菌包括開菲爾乳桿菌、明串珠菌、短乳桿菌、嗜酸乳桿菌、發酵乳桿菌等乳桿菌;不同來源的開菲爾粒，占優勢的乳桿菌的種也不同。通過對本實驗室中開菲爾粒中乳酸菌的篩選表明，其主要的優勢乳桿菌為開菲爾乳桿菌。本次試驗中只分離出了開菲爾乳桿菌和嗜熱鏈球菌，未分離出其他菌株，其原因之一為初篩時菌種太多，分離現象不明顯造成分離篩選過程中漏檢個別菌株;原因之二可能為Rosi等人認為開菲爾中存在乳球菌、明串株菌以及醋酸菌和腸球菌是因為開菲爾生產過程中無菌條件差造成的。

因此，在以后菌株的分離篩選中應增加菌株分離篩選的明顯性特征，并針對不同菌株采用不同的分離條件，以增加分離不同菌株的可能性。

［1］張列兵，劉鵬，程濤等．酸牛奶酒(kefir)工藝學研究進展評論［J］．中國乳品工業，1996

［2］Koroleva NS．21IDF．Moscow，1982

［3］Grag S K．Indian Dairyman，1989

［4］張列兵，程濤．Kefir的營養特性及保健作用［J］．中國乳品工業，1997

［5］余東霞．一種新型發酵乳—Kefir［J］．中國乳品工業，1999

［6］可應用于食品的菌種名單(衛辦監督發［2010］65號)

［7］可用于保健食品的益生菌菌種名單(衛法監發〔2001〕84號)

［8］ANGULO L，LOPENZ E，LEMA．C．Microflora region(north－ west of spain)［J］．Journal of dairy research，1993

［9］LIN C W，KUO C Y．Identification and characterization of lactic acid bacteria and yeasts isolated from kefir grains in Taiwan［J］．AUS － TRALIAN．Journal of dairy technolog，1999

［10］KANDLER O，KUNATH P．Lactobacillus kefir sp．nov，a component of the microflora of kefir［J］．systematic and applied microbiology，1983，4:286 ～294

［11］ROSI J．kefir microorganisms:lactic acid bacteria［J］．Scieza e tecnica Lattiero－ casesria，1978