脊柱結核基因診斷進展

脊柱結核基因診斷進展

鐘志偉，黃艷，彭艷，武漢*

(吉林大學中日聯誼醫院 骨科，吉林 長春130033)

隨著HIV肆虐及免疫缺陷病患者的增加，全球結核發病有明顯上升趨勢，中國是全球22個結核病高負擔國家之一[1]， 結核患者數居世界第2位，脊柱結核作為常見的繼發性肺外結核發病率也明顯增加。目前脊柱結核的診斷主要是根據臨床表現、影像特征、實驗室檢查及診斷性治療情況進行綜合診斷[2]，現行的實驗室診斷和耐藥性檢測及菌種鑒定方法遠不能滿足脊柱結核早期診治的需求，迫切需要加強新技術的研究和應用。近年來，基因診斷作為疾病診斷的研究熱點正逐步應用于臨床，其對疾病診斷價值已得到廣泛認同，本文將主要從常用脊柱結核基因診斷技術、基因診斷的優缺點及相關研究進展方面作一綜述。

基因診斷又稱DNA診斷，它是利用重組DNA技術，直接從基因水平檢測致病微生物的存在和種類，從而對臨床疾病作出診斷。1972年Goff SP和Berg P首次成功重組了世界上第一批DNA分子，標志著基因檢測技術的誕生[3]。20世紀70年代中后期，由于PCR、基因芯片等技術的出現基因檢測得到了快速發展[4]。從病原學角度，基因診斷可應用于各種病毒、細菌和寄生蟲病的檢測，隨著結核分枝桿菌全基因組測序工作的完成，結核疾病的診斷也進入了基因時代，基因診斷技術在脊柱結核診斷領域的應用已越來越被人們所認識，它在病原體檢測、藥物選擇和療效評價等方面具有重要作用，必將為脊柱結核的防控和診治作出重大貢獻。

1常用脊柱結核基因診斷技術

脊柱結核是結核分枝桿菌全身感染的局部表現，約占骨關節結核50%，好發于兒童和青少年[5]。以腰椎最為多見，胸椎次之，胸腰段占第三位，頸椎和骶椎較少見。其中，椎體結核約占99%、椎弓結核占1%左右。受累的脊柱表現有骨質破壞及壞死，有干酪樣改變和膿腫形成，椎體因病變和承重而發生塌陷，嚴重者可造成癱瘓[6]。由于脊柱結核患者早期典型臨床特征不明顯，很容易造成誤診或者漏診，目前脊柱結核診斷仍以臨床癥狀結合X線、CT、MRI表現為主要診斷手段，尚缺乏敏感度高、特異性強的早期診斷指標[7]。應用基因診斷技術對脊柱結核的早期發現、脊柱結核患者的耐藥監測、療效判斷等都具有較大的臨床使用價值和意義。目前常用的脊柱結核基因檢測技術主要有聚合酶鏈反應( polymerase chain reaction， PCR)、基因芯片、核酸雜交等。

1.1　聚合酶鏈反應( polymerase chain reaction，PCR)技術

聚合酶鏈反應技術是指在體外由引物介導的DNA序列酶促合成反應，即體外DNA擴增技術，包括變性、退火及延伸等幾步反應，具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、省時等特點。它不僅可用于基因分離、克隆和核酸序列分析等基礎研究，還可用于疾病的診斷[8]。Hance等[9]最先把PCR技術應用到結核桿菌的診斷，擴增出一383bp序列，編碼65kD分枝桿菌抗原，再用探針雜交，敏感度達到樣品細菌數少于100個即可被檢出的水平。對于骨關節結核基因診斷的報道始于1994年Lombard EH等[10]利用基因診斷技術檢測24名疑似骨結核病患者的骨髓液，其陽性率達到42%，明顯高于涂片抗酸染色法。隨后Sun Y等[11]也應用PCR技術檢測60名骨結核病人骨髓液，陽性率為83%，發現基因檢測技術對診斷骨關節結核具有重要應用價值。作為簡單有效的診斷方法，PCR技術在脊柱結核的診斷中已發揮了顯著作用。Li等[12]采用熒光定量PCR技術及抗酸染色法對208例結核病患者痰液中結核分枝桿菌進行檢測，結果顯示兩種方法檢出陽性率分別為51.92%和25.96%， PCR法檢出的陽性率明顯高于抗酸染色法檢出的陽性率。同樣Portillo-Gomez等[13]運用不同方法檢測286例肺外結核病人腦脊液、胸膜液及腹水中結核分枝桿菌，發現PCR技術的特異性、敏感性最高。Bahram等[14]發現，通過多重實時定量PCR對不同管家基因的測定，可以快速準確地鑒別結核分枝桿菌屬和非結核分枝桿菌屬，對臨床脊柱結核疾病診斷具有重要作用。此外，研究表明，MCP-1-2518 位點GG 基因型和G 等位基因均可能與脊柱結核的易感性相關，通過PCR技術檢測人群基因組DNA中MCP-1-2518 位點的G、A 等位基因的分布頻率[15]，可以預測患者罹患脊柱結核的風險，從而對易感人群進行預防性保護。

1.2　基因芯片

隨著分子生物學技術的不斷發展，基因診斷在脊柱結核診斷中作用日益明顯，而基因芯片技術的發展成為脊柱結核耐藥基因診斷的一個新里程碑，基因芯片是通過微陣列技術將大量的DNA片段有序地、高密度地排列在玻璃片或纖維膜等載體上，然后與標記的樣品雜交，通過對雜交信號的檢測分析，即可獲得樣品的遺傳信息[16]，是伴隨“人類基因組計劃”的研究進展而快速發展起來的一門高新技術。Zhang等[17]最先將基因芯片用于脊柱結核診斷，研究表明在對153名脊柱結核患者利福平及異煙肼耐藥檢測中，CapitalBio? 基因芯片靈敏度達到93.55%?，檢測過程平均用時僅5.8小時，具有高通量檢測、靈敏準確、高效快速等優點。隨著結核病疫情不斷惡化，脊柱結核發病率及復發率亦逐年增加，耐藥結核、耐多藥結核甚至廣泛耐藥結核的流行是主要原因之一[18]。通過基因芯片技術診斷耐藥脊柱結核，可有效控制患者復發率。近年生物技術不斷發展，結核分枝桿菌耐藥相關基因及相關位點突變不斷被分析鑒定[19]，通過對相關耐藥基因設計芯片進行檢測，即可判斷脊柱結核患者耐藥情況，為患者選擇有效藥物治療方案提供依據，也是治愈結核病、控制結核病流行的前提[20]。例如利福平耐藥相關基因主要為rpoB[21]，Gingeras等[22]利用rpoB基因保守區705bp的核苷酸探針，對44株結核分枝桿菌利福平耐藥分離株進行檢測，發現了40株存在rpoB基因的突變，突變檢出率為90.9%，表明基因芯片用于結核耐藥檢測的敏感性、特異性均較高，且檢測結果與基因測序完全一致[23]，為后期患者進一步治療提供參考。近年來國內外學者的研究已初步證實，基因芯片技術對結核分枝桿菌利福平、異煙肼耐藥檢測具有高度的準確性[24]，而且基因芯片耐藥檢測是基于DNA片段的檢測，安全性高，開展性廣。

1.3　核酸雜交

核酸雜交是指用標記的已知DNA或RNA片段(探針)來檢測樣品中未知核酸序列(形成異源雙螺旋)，再經顯影或顯色的方法，將結合核苷酸序列的位置或大小顯示出來。結核分枝桿菌基因組中含有特異的高度重復序列，將這些重復序列作為靶基因，用核酸雜交和PCR等技術對脊柱結核患者進行特異性檢測就可達到基因診斷的目的[25]。目前主要核酸雜交技術包括膜上印跡雜交、斑點雜交、原位雜交。這些方法在臨床診斷中都已得到應用，與脊柱結核的疾病診斷也密切相關[26]。LIANG等[27]采用反向斑點雜交技術分析鑒定37例脊柱結核術后患者病理組織或膿液抗酸染色陽性標本的分枝桿菌菌種，結果表明與傳統診斷方法相比，核酸雜交技術可快速高效準確地鑒定脊柱結核分枝桿菌菌種，降低誤診漏診率，同時為脊柱結核患者有效治療爭取了時間。核酸雜交技術簡便、快速、靈敏，CHEN等[28]研究發現膜反向斑點雜交技術可以直接檢測結核分枝桿菌katG、rpoB 基因突變，為臨床檢測結核分枝桿菌的耐藥性提供輔助診斷手段，同時也為該技術的進一步推廣，應用于其它的病原微生物及基因突變檢測領域奠定了一定的實驗基礎。

目前的研究[29]表明，與傳統藥物敏感性檢測方法相比，核酸雜交技術可在臨床結核桿菌快速耐藥檢測中一次性對多種耐藥基因的多種基因位點進行快速基因型鑒定，具有檢測信息量大的特點，臨床應用前景極大[30]。

2基因診斷的優缺點及展望

2000年人類基因組草圖的公布，標志著現代醫學的發展已進入“基因組醫學”時代[31]。基因診斷技術雖然僅短短20多年歷史，但發展迅速，在臨床診治中得到廣泛應用。目前對于脊柱結核的實驗室診斷主要依據細菌學檢查，雖然細菌學檢查是結核病確診的金標準，但其培養周期長、繁瑣費時、影響因素多，不能作為快速診斷方法。與之相比，基因診斷具有很突出的優點，主要包括：第一特異性高，通過選用特異性高的分子探針作為工具，可有針對性的檢測樣本特異表達基因的差異情況。第二靈敏度高，通過PCR技術，將檢測的信號不斷放大，即使是微量的樣品也能得出精確的結果。第三穩定性和重復性好。第四，早期快速診斷性，只要外源基因進入或者基因發生變化，不管處于何種時期，都可以有效診斷，而且用時短，操作方便[32]。基因診斷的臨床價值是值得肯定的，但近年來的臨床實踐也證明其仍具有一定的局限性。首先針對PCR技術缺點主要表現在假陽性[33]。PCR的敏感性極高,微量的污染即可導致假陽性的發生，這是PCR技術假陽性發生的最主要原因。所以在標本收集至整個操作過程中的各個環節必須保證嚴格的“無菌操作”，以避免污染；同時提高引物特異性也是避免假陽性發生的關鍵。而基因芯片雖然在結核耐藥診斷研究中意義重大，但由于目前基因芯片技術尚不夠完善，還在不斷發展，特別是其價格昂貴、對操作的要求較高、重復性差等使其應用范圍受到很大限制，這些問題主要需從樣品的制備、探針合成固定、分子的標記等方面著手解決。

脊柱結核早期診斷可以有效預防患者并發癥的出現，對于我國來說，面對結核病死灰復燃、脊柱結核病例逐年攀升的嚴峻挑戰，對脊柱結核病的預防和早期診斷是一項非常值得探討的重大課題。基因診斷作為新興疾病診斷技術，近年來取得了重大進展，包括PCR、基因芯片以及核酸雜交等技術比傳統方法更特異、敏感、快速，對臨床鑒定及流行病學研究都產生了深遠的影響。但是，由于技術上的難點和高昂的成本，基因診斷還存在著諸多缺點有待進一步解決和提高。客觀地講,限于目前的技術水平,基因診斷方法還不能完全替代常規診斷手段,它只是作為常規診斷的輔助方法。但隨著基因組計劃的深入開展和科技的不斷發展，基因診斷技術將會更加完善并在臨床上逐步得到普及。

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收稿日期：(2014-08-18)

作者簡介：鐘志偉(1986-)，男，碩士研究生，研究方向：脊柱外科；武漢(1967-)，男，博士，主任醫師，教授，碩士生導師。

文章編號：1007-4287(2015)01-0165-04

通訊作者*

基金項目：國家自然科學基金資助項目(編號：30772209)