基于細(xì)胞面積估計(jì)的藍(lán)藻細(xì)胞計(jì)數(shù)

胡洋洋， 王 鑫

(江南大學(xué) 教育部輕工過程先進(jìn)控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214122)

環(huán)境問題是我國可持續(xù)發(fā)展面臨的重大問題，水污染是環(huán)境問題中的重點(diǎn)之一。太湖水污染導(dǎo)致藍(lán)藻水華爆發(fā)，造成嚴(yán)重的后果。因此，淡水水體中的藍(lán)藻細(xì)胞濃度的測量十分重要。目前，測量細(xì)胞濃度的方法主要有:細(xì)胞計(jì)數(shù)儀法、菌落計(jì)數(shù)器法、庫爾特計(jì)數(shù)器法、分光光度測定法［1］和熒光法、流式細(xì)胞儀法、細(xì)胞計(jì)數(shù)傳感器法［2］與圖像處理法［3］。

調(diào)研與實(shí)驗(yàn)表明，在基于圖像處理的細(xì)胞計(jì)數(shù)［4］中，主流方法是先圖像分割，再進(jìn)行隔離標(biāo)記計(jì)數(shù)，該方法對細(xì)胞圖像的前期分割處理要求很高，而且對細(xì)胞較多或細(xì)胞粘連程度較大的圖片進(jìn)行計(jì)數(shù)的結(jié)果誤差很大;而常用的基于細(xì)胞核定位的計(jì)數(shù)方法對原核細(xì)胞的藍(lán)藻細(xì)胞而言也是不適用的;已有的基于面積的紅細(xì)胞計(jì)數(shù)方法［5］則沒有經(jīng)過細(xì)胞預(yù)分割環(huán)節(jié)，直接根據(jù)每個(gè)不連通區(qū)域的大小判斷該區(qū)域代表的細(xì)胞數(shù)目，再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)，該方法對于平均細(xì)胞面積獲取的先驗(yàn)性很差，而且最終計(jì)數(shù)結(jié)果誤差較大。

針對以上問題，文中提出了基于細(xì)胞面積估計(jì)的細(xì)胞計(jì)數(shù)法(簡稱“面積法”)。特別地，為了改善細(xì)胞面積估計(jì)的精度，將二值化后的細(xì)胞圖像中的細(xì)胞面積作為一個(gè)隨機(jī)變量，并借助基于核平滑的概率密度估計(jì)找到了單個(gè)細(xì)胞面積最可能的值。

1 理論分析

細(xì)胞計(jì)數(shù)的圖像處理法，是將原始顯微細(xì)胞圖像進(jìn)行二值化，預(yù)分割以后再進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.1 圖像預(yù)處理

在用顯微鏡獲取細(xì)胞溶液的圖片后，首先要進(jìn)行圖像預(yù)處理。圖像預(yù)處理包括對輸入圖像進(jìn)行特征提取、分割以及匹配前所進(jìn)行的處理。圖像預(yù)處理的主要目的是消除圖像中無關(guān)的信息，恢復(fù)有用的真實(shí)信息，增強(qiáng)有關(guān)信息的可檢測性，最大限度地簡化數(shù)據(jù)，從而改進(jìn)特征抽取、圖像分割、匹配和識(shí)別的可靠性。預(yù)處理的方法有很多，在細(xì)胞計(jì)數(shù)中主要應(yīng)用到的是二值化［6］和形態(tài)學(xué)運(yùn)算［7-8］。

二值化是圖像分割的一種方法。在二值化圖像時(shí)把大于某個(gè)臨界灰度值的像素灰度設(shè)為灰度極大值，把小于這個(gè)值的像素灰度設(shè)為灰度極小值，從而實(shí)現(xiàn)二值化。臨界灰度值也稱閾值。根據(jù)閾值的選取準(zhǔn)則不同，二值化的算法分為固定閾值和自適應(yīng)閾值。比較常用的二值化閾值選取算法有:雙峰法、P 參數(shù)法、迭代法與OTSU 法［9］等。文中二值化域值選取的是OTSU 法。它是一種基于灰度直方圖的閾值選取方法。它選取使類間方差最大的灰度級作為分割閾值。

距離變換是對二值圖像的一種操作運(yùn)算，它將一幅二值圖像轉(zhuǎn)化為一幅灰度圖像，在這幅灰度圖像中，每個(gè)像素的灰度級是該像素與距其最近的背景間的距離。從理論上講，要計(jì)算一個(gè)像素點(diǎn)到背景像素點(diǎn)的最短距離，需要對圖像進(jìn)行全局操作運(yùn)算，即計(jì)算此像素點(diǎn)與所有背景像素點(diǎn)的距離，再取最小值。除非這幅數(shù)字圖像的尺寸非常小，否則這種全局操作的計(jì)算量是非常大的。實(shí)際運(yùn)用中的距離變換實(shí)現(xiàn)算法是從鄰近像素點(diǎn)入手，每次只計(jì)算其與局部相鄰的幾個(gè)像素點(diǎn)距離的最小值，根據(jù)全局距離是局部距離按比例疊加而成的原理，對圖像進(jìn)行前后兩次掃描，最終得到近似的距離。圖像基于上述原理，實(shí)踐中用倒角算法進(jìn)行距離變換，簡單快速，其計(jì)算出的距離合理逼近于真實(shí)的歐氏幾何距離。

分水嶺算法［10］最早是由Vincent L 和Soille P提出來的。分水嶺算法是模擬一個(gè)水面浸沒地形的過程。在分水嶺算法中，圖像中每一點(diǎn)像素的灰度值表示該點(diǎn)的海拔高度，每一個(gè)局部極小值及其影響區(qū)域稱為集水盆，而集水盆的邊界則形成分水嶺。最后得到的分水嶺邊界將原圖像粘連細(xì)胞切割開。

1.2 基于細(xì)胞面積估計(jì)的細(xì)胞計(jì)數(shù)

在完成以上的圖像預(yù)處理后，即可進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。通常基于隔離標(biāo)記計(jì)數(shù)法的細(xì)胞計(jì)數(shù)是對二值化后的圖像各個(gè)分離區(qū)域進(jìn)行標(biāo)記并累加計(jì)數(shù)，從而得到圖片中細(xì)胞的數(shù)目。這種方法的一個(gè)基本假定是一個(gè)隔離區(qū)域代表一個(gè)細(xì)胞，但在高度粘連(部分區(qū)域粘連呈塊狀)的細(xì)胞圖像中，經(jīng)過預(yù)分割后仍然會(huì)出現(xiàn)多個(gè)細(xì)胞粘連的單個(gè)分離區(qū)域，隔離標(biāo)記計(jì)數(shù)法對于這種情況的計(jì)數(shù)仍然為1，并沒有反映真實(shí)情況。

文中假定經(jīng)過預(yù)分割的細(xì)胞圖像中還存在重疊細(xì)胞，且重疊細(xì)胞是少數(shù)。在此前提下，將圖片中分離的細(xì)胞區(qū)域的面積作為一個(gè)隨機(jī)變量，通過核平滑對其進(jìn)行概率密度估計(jì)，得到它的概率密度函數(shù)曲線。假設(shè)重疊細(xì)胞較少，該曲線的極大值對應(yīng)的細(xì)胞區(qū)域面積即為單個(gè)細(xì)胞面積最可能的值，即前述隨機(jī)變量的眾數(shù)。用圖像中細(xì)胞區(qū)域的總面積除以前面得到的單個(gè)細(xì)胞面積最可能的值，即可算出圖像中的細(xì)胞總數(shù)。

之所以使用眾數(shù)而不是均值作為細(xì)胞面積最可能的值，是因?yàn)樵逡褐械募?xì)胞生長速度不一定一樣，有各個(gè)生長階段的細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞大小參差不齊。

特別地，細(xì)胞面積估計(jì)中用到的基于核平滑的概率密度估計(jì)［11］是概率論中用以估計(jì)隨機(jī)變量的概率函數(shù)密度的方法之一。它采用平滑的峰值函數(shù)(“核”)［12］擬合觀察到的數(shù)據(jù)點(diǎn)，從而對真實(shí)的概率分布曲線進(jìn)行模擬。在一定程度上其性質(zhì)比直方圖更好，可以替代直方圖精確展示數(shù)據(jù)總體的概率分布。

2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.1 細(xì)胞圖像來源

文中實(shí)驗(yàn)采用的細(xì)胞圖像均來自業(yè)界權(quán)威的細(xì)胞計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)樣本圖像網(wǎng)站(www.broad.mit.edu/bbbc)。

2.2 圖像預(yù)處理

首先讀取RGB 格式的原始圖片，將彩色圖像通過加權(quán)平均法轉(zhuǎn)化為灰度圖像，再采用OTSU 方法將圖像二值化，然后采用形態(tài)學(xué)閉運(yùn)算填充細(xì)胞內(nèi)空隙。該方法處理以后的細(xì)胞圖像，能平滑細(xì)胞區(qū)域邊界并可以最大程度地保持細(xì)胞區(qū)域面積不變，圖像信息完整。

2.3 距離變換分水嶺分割

將得到的二值化細(xì)胞圖像進(jìn)行歐氏距離變換并采用分水嶺算法進(jìn)行初步預(yù)分割，將粘連程度不大的細(xì)胞區(qū)域分割開，便于后續(xù)操作。

該算法原理是:首先利用距離變換將細(xì)胞像素點(diǎn)不同的位置信息轉(zhuǎn)化為不同的灰度信息，再利用分水嶺算法區(qū)分不同性質(zhì)的像素點(diǎn)，然后將邊界點(diǎn)標(biāo)出，邊界即可將細(xì)胞群分開為單個(gè)的細(xì)胞。

2.4 “面積法”細(xì)胞計(jì)數(shù)

使用高斯核作為概率密度估計(jì)［13-14］的平滑核函數(shù)，并限定概率密度函數(shù)的取值范圍為非負(fù)實(shí)數(shù)集，對分離的細(xì)胞區(qū)域面積進(jìn)行概率密度估計(jì)，得到單個(gè)細(xì)胞面積最可能的值。最后，圖像中細(xì)胞區(qū)域的總面積除以單個(gè)細(xì)胞面積最可能的值，得到圖像中的細(xì)胞總數(shù)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

圖1 為預(yù)分割粘連細(xì)胞區(qū)域圖像。其中，圖1(a)與圖2(b)是兩張實(shí)驗(yàn)用的細(xì)胞圖像經(jīng)過圖像預(yù)處理后的一部分，對它們進(jìn)行距離變換以及分水嶺算法分割后得到圖1(c)和圖1(d)的效果。

由圖1 可以看出，經(jīng)過預(yù)分割后的細(xì)胞圖像，粘連程度低的細(xì)胞區(qū)域被分割開。預(yù)分割后的細(xì)胞圖像中，單個(gè)細(xì)胞的數(shù)量占大多數(shù)。再對預(yù)分割后的圖像中細(xì)胞區(qū)域面積進(jìn)行高斯核密度估計(jì)，具體結(jié)果如圖2 所示。其中，* 所對應(yīng)X 軸的值就是估計(jì)出的細(xì)胞平均面積S。

最后，用整個(gè)細(xì)胞圖中的細(xì)胞區(qū)域的總面積Sum除以各自的單個(gè)細(xì)胞面積最可能的值S，得到圖像中細(xì)胞的總數(shù)。經(jīng)過計(jì)算統(tǒng)計(jì)得到最終結(jié)果(見表1)。本實(shí)驗(yàn)選取輕度粘連和高度粘連兩種程度的圖像，每種粘連程度取10 張樣本圖像，計(jì)數(shù)結(jié)果是10 個(gè)樣本的平均值，并進(jìn)行了四舍五入的處理。所有的樣本圖像均含有300 個(gè)細(xì)胞。顯微圖像放大倍數(shù)為1 000 倍。

圖1 預(yù)分割粘連細(xì)胞區(qū)域圖像Fig.1 Area image the pre-segmentation adhesion cell

圖2 核密度估計(jì)的細(xì)胞平均面積Fig.2 Cell average area of the kernel density estimation

表1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Experimental results

由表1 可以看出，不連通區(qū)域標(biāo)記法雖然能較好地處理含細(xì)胞較少或粘連度較小的圖片，但是對含細(xì)胞較多特別是粘連程度較大的圖片進(jìn)行計(jì)數(shù)所得出的細(xì)胞數(shù)結(jié)論誤差較大。而“面積法”在這兩種不利情況下得出的結(jié)論都有較高的準(zhǔn)確度，不僅能對細(xì)胞數(shù)較少粘連程度低的圖片準(zhǔn)確計(jì)數(shù)，還能對粘連程度大的細(xì)胞圖片進(jìn)行精確的細(xì)胞計(jì)數(shù)。

4 結(jié) 語

文中使用圖像處理技術(shù)對藍(lán)藻細(xì)胞的顯微鏡圖像進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。提出的“面積法”克服了不連通區(qū)域標(biāo)記法對分割后的細(xì)胞圖像進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)不能有效處理細(xì)胞數(shù)較多或細(xì)胞粘連程度較大情況，有效地解決了復(fù)雜情況下的細(xì)胞計(jì)數(shù)問題。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，“面積法”對于細(xì)胞高粘度圖像的計(jì)數(shù)優(yōu)勢明顯，計(jì)數(shù)精度達(dá)97%，而普通不連通區(qū)域計(jì)數(shù)法的計(jì)數(shù)精度只有72%，表明“面積法”的計(jì)數(shù)準(zhǔn)確度與穩(wěn)定性遠(yuǎn)高于隔離標(biāo)記計(jì)數(shù)法。此外，由于概率方法的引入，“面積法”本質(zhì)上對圖像中的不確定因素不敏感，故對圖像的質(zhì)量及圖像預(yù)處理的要求較低。

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