磷酸鹽濃度對(duì)測(cè)定替卡西林鈉/克拉維酸鉀(15:1)中高分子雜質(zhì)分離效果的影響

林波，文隨方，云沖,*，向世英,*

(1 海南醫(yī)學(xué)院 海南省腫瘤發(fā)生和干預(yù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 海口 571199；2 海南通用三洋藥業(yè)有限公司, 海口 570312)

替卡西林鈉/克拉維酸鉀(15:1)是β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素，控制該類(lèi)抗生素的高分子雜質(zhì)的含量，是減少過(guò)敏反應(yīng)的關(guān)鍵[1]。克拉維酸鉀是β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，可保護(hù)替卡西林鈉不受β-內(nèi)酰胺酶的破壞。中國(guó)藥典2010年版二部注射用替卡西林鈉/克拉維酸鉀標(biāo)準(zhǔn)中未檢查高分子雜質(zhì)，目前國(guó)內(nèi)主要采用Sephadex G10凝膠色譜系統(tǒng)測(cè)定β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素中高分子雜質(zhì)[2]，但在該系統(tǒng)下，克拉維酸鉀的出峰位置與高分子雜質(zhì)相同，因此不能用它測(cè)定這種藥品。

文獻(xiàn)報(bào)道的這種藥物的檢測(cè)方法是利用TSK-GEL G2500PWxl凝膠系統(tǒng)分離，但報(bào)道的方法由于選取的磷酸鹽濃度不合適，不能把替卡西林鈉克拉維酸鉀分離，不能得到較好的檢測(cè)結(jié)果[3]。本試驗(yàn)通過(guò)考察不同濃度的磷酸鹽對(duì)測(cè)定替卡西林鈉克拉維酸鉀(15:1)中高分子雜質(zhì)分離效果的影響，找出較好的磷酸鹽緩沖液作為流動(dòng)相，使替卡西林、克拉維酸及高分子雜質(zhì)的峰達(dá)到很好的分離。并通過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證。

1 試驗(yàn)條件及方法

1.1 儀器與試驗(yàn)藥物

戴安高效液相色譜儀(型號(hào)：Thermo/Ultimate3000)，變色龍7色譜工作軟件。

注射用替卡西林鈉/克拉維酸鉀(15:1) 樣品，由海南通用三洋藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)為131001、131003及131006；對(duì)照品替卡西林(批號(hào)130569-200902，含量84.0% )購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)及溶媒的選擇

通過(guò)紫外掃描，本品中高分子雜質(zhì)及主成分均在230 nm處有較大的吸收，故采用230 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。以水為溶媒時(shí)，溶劑峰干擾樣品的測(cè)定，而選擇流動(dòng)相作為溶媒時(shí)，對(duì)樣品測(cè)定無(wú)干擾。

1.2.2 色譜條件

采用TSK-GEL G2500PWxl(7.8 mm×30cm，粒徑7μm)色譜柱，檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm柱溫30℃。

1.2.3 測(cè)定法

取本品適量，精密稱(chēng)定，用流動(dòng)相溶解并定量稀釋制成每1mL中含替卡西林鈉1.0mg的溶液，作為供試品溶液(臨用新配)；另取替卡西林對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加流動(dòng)相溶解并定量稀釋制成每1mL中約含10μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。精密量取供試品溶液與對(duì)照品溶液各20μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖；供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算保留時(shí)間小于替卡西林鈉的雜質(zhì)總量。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 流動(dòng)相的選擇

以不同濃度的磷酸鹽緩沖液作為流動(dòng)相：A.0.02mol/L磷酸氫二鈉-0.02mol/L磷酸二氫鈉(95:5)；B. 0.03mol/L磷酸氫二鈉-0.03mol/L磷酸二氫鈉(95:5)；C. 0.04mol/L磷酸氫二鈉-0.04mol/L磷酸二氫鈉(95:5)；D. 0.05mol/L磷酸氫二鈉-0.05mol/L磷酸二氫鈉(95:5)。考察高分子雜質(zhì)峰與主峰的分離情況，結(jié)果見(jiàn)圖1和表1。

從圖1中看，在一定范圍內(nèi)，隨著磷酸鹽濃度的增大，主峰替卡西林出峰時(shí)間越晚。高分子雜質(zhì)峰與主峰的距離越大，但隨著磷酸鹽濃度的增大，主峰拖尾越嚴(yán)重，當(dāng)磷酸鹽濃度的增大到D濃度時(shí)[0.05mol/L磷酸氫二鈉-0.05mol/L磷酸二氫鈉(95:5)]，由于主峰拖尾嚴(yán)重已不能和克拉維酸很好分離。

從圖1看，C濃度[0.04mol/L磷酸氫二鈉-0.04mol/L磷酸二氫鈉(95:5)]的三個(gè)峰分離度較好。從表1數(shù)據(jù)中也看出C濃度的分離效果較好。因此利用它作為流動(dòng)相，進(jìn)行一下步的方法學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

分別采用A： 0.1mol/L氫氧化鈉溶液，B：0.1mol/L鹽酸溶液，C：照度為(4500±500)LX強(qiáng)光，D：60℃高溫及下放置10 d，E：30%的雙氧水溶液強(qiáng)制破壞試驗(yàn)考察本品高分子雜質(zhì)與主峰的分離情況。結(jié)果供試品經(jīng)破壞后，高分子雜質(zhì)均有增加，其中經(jīng)堿破壞及氧化破壞后高分子雜質(zhì)增加尤為明顯。結(jié)果表明，高分子雜質(zhì)峰與主峰有效分離，本色譜系統(tǒng)專(zhuān)屬性良好，分析結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.2.2 儀器精密度試驗(yàn)

取替卡西林對(duì)照品適量，流動(dòng)相溶解并定量稀釋制成每1mL中約含10μg的溶液，作對(duì)照品溶液。精密量取對(duì)照品溶液20μL注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算主峰面積的RSD為0.40%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.2.3 檢測(cè)限、定量限測(cè)定

圖1 替卡西林鈉克拉維酸鉀(15:1)中的高分子雜質(zhì)(在A、B、C、D 4種流動(dòng)相體系下的分離)

取替卡西林對(duì)照品溶液，逐步稀釋?zhuān)辽V圖中主峰的峰高約為基線噪音的3倍(檢測(cè)限)及基線噪音的10倍(定量限)，計(jì)算得替卡西林的檢測(cè)限為50ng(S/N≈3)，定量限為300ng(S/N≈10)。

2.2.4 對(duì)照品線性試驗(yàn)

稱(chēng)取替卡西林對(duì)照品12.82mg，置于100mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻；分別精密量取1.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL、6.0mL、7.5mL和10mL，分別置于50mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為20%、60%、80%、100%、120%、150%和200%的對(duì)照品溶液。精密量取上述溶液各20μl注入液相色譜儀，將測(cè)得峰面積與進(jìn)樣量作線性回歸。試驗(yàn)結(jié)果表明：對(duì)照品溶液在2.154 μg/mL~21.538 μg/mL濃度范圍有良好的線性關(guān)系，線性方程與相關(guān)系數(shù)為：Y=0.4075X+0.0157；r=0.99998。

表1 不同磷酸鹽濃度流動(dòng)相對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

2.2.5 供試品溶液濃度與高分子雜質(zhì)相關(guān)性試驗(yàn)

圖2 專(zhuān)屬性試驗(yàn)HPLC圖

分別稱(chēng)取樣品(批號(hào)：131001)適量，加流動(dòng)相溶解并定量稀釋制成每1mL中約0.5mg、0.8mg、1.0mg、1.2mg、1.5mg和2.0mg替卡西林鈉的溶液，相當(dāng)于高分子雜質(zhì)測(cè)定供試品溶液濃度的50%、80%、100%、120%、150%和200%，精密量取上述溶液各20μL，分別注入液相色譜儀，結(jié)果供試品溶液在0.504mg/mL~1.997mg/mL濃度范圍，有良好的線性關(guān)系，線性方程Y=3.3941X-0.0238；r=0.9995。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

稱(chēng)取樣品(批號(hào)：131001)適量，加流動(dòng)相溶解并定量稀釋制成每1mL中含替卡西林鈉1.0mg的溶液，作供試品溶液(臨用新配)，平行配制六份，分別為：0.716mg、0.718mg、0.730mg、0.728mg、0.728mg、0.734mg精密稱(chēng)取替卡西林對(duì)照品適量，加流動(dòng)相溶解并稀釋制成每1mL中約含替卡西林10μg的溶液，作對(duì)照品溶液。精密量取上述供試品溶液和對(duì)照品溶液取各20μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖；按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算保留時(shí)間小于替卡西林鈉的雜質(zhì)總量。其平均值(%)為0.726；RSD(%)為0.50。試驗(yàn)結(jié)果表明測(cè)定方法的重復(fù)性良好。

2.2.7 中間精密度試驗(yàn)

取本品(批號(hào)：131001)，照重復(fù)性試驗(yàn)項(xiàng)下的方法，由兩個(gè)試驗(yàn)人員，在不同日期，使用兩臺(tái)高效液相色譜儀檢測(cè)，根據(jù)記錄的色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算保留時(shí)間小于替卡西林鈉高分子雜質(zhì)總量。測(cè)定12份樣品的高分子雜質(zhì)(%)分別為0.716、0.718、0.730、0.728、0.728、0.734、0.744、0.746、0.740、0.750、0.731、0.737，其平均值為0.734；試驗(yàn)結(jié)果表明：RSD(%)=1.4%，小于5%，中間精密度結(jié)果良好，能滿(mǎn)足本品高分子雜質(zhì)測(cè)定要求。

2.2.8 樣品的檢測(cè)

取本公司生產(chǎn)的3批注射用替卡西林鈉克拉維酸鉀(15:1)，批號(hào)為131001、131003、131006，采用TSK-GEL G2500PWxl凝膠色譜系統(tǒng)測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

3.1 流速及柱溫的選擇

為了考察色譜條件的耐用性，故作了以下不同流速及柱溫下的試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。

結(jié)果表明，替卡西林鈉與高分子雜質(zhì)的分離度均大于1.5，此色譜條件的耐用性結(jié)果良好。在保證主峰出峰時(shí)間，以及替卡西林鈉與高分子雜質(zhì)分離度的前提下，選擇了0.8mL/min作為流速，柱溫為30℃。

表2 樣品測(cè)定

表3 不同流速及柱溫下替卡西林鈉與高分子雜質(zhì)峰分離度

3.2 與文獻(xiàn)報(bào)道方法比較

文獻(xiàn)報(bào)道的這種藥物的檢測(cè)方法選取的磷酸鹽濃度為0.15mol/L磷酸氫二鈉：0.15mol/L磷酸二氫鈉(95:5)為流動(dòng)相，不太合適，因?yàn)樵谶@個(gè)濃度下，其替卡西林主峰由于拖尾嚴(yán)重而和克拉維酸峰混在一起，而且其高分子峰也變形為兩個(gè)峰，不能得到較好的檢測(cè)結(jié)果[3]。而我們的方法可以使高分子、替卡西林和克拉維酸三個(gè)峰分離度較好，而且三個(gè)峰的峰形也較好。

3.3 結(jié)論

采用0.04mol/L磷酸氫二鈉-0.04 mol/L磷酸二氫鈉(95:5)為流動(dòng)相，測(cè)定替卡西林鈉克拉維酸鉀(15:1)中的高分子雜質(zhì)，替卡西林鈉與高分子雜質(zhì)可以達(dá)到很好的分離。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證表明，本法專(zhuān)屬性、相關(guān)性、重現(xiàn)性良好，操作簡(jiǎn)單、快速，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，可用于替卡西林鈉克拉維酸鉀(15:1)中的高分子雜質(zhì)檢測(cè)。

[1] 胡昌勤. β-內(nèi)酰胺抗生素聚合物分析技術(shù)展望[J]. 中國(guó)新藥雜志, 2008, 17(24):2098-2112.

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