實驗教學(xué)中生物光學(xué)顯微鏡的常見問題及解決辦法

嚴家來，孟德娣，張建軍，陳雨京，朱先梅，張發(fā)蘇

（安徽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，安徽 合肥 230601）

生物光學(xué)顯微鏡是一種精密的光學(xué)儀器，是一種重要的實驗教學(xué)設(shè)備，對于形態(tài)學(xué)觀察至關(guān)重要。經(jīng)統(tǒng)計，在醫(yī)學(xué)專業(yè)開設(shè)的病理學(xué)、組織胚胎學(xué)、臨床檢驗基礎(chǔ)、寄生蟲學(xué)檢驗、血液學(xué)檢驗、微生物學(xué)檢驗及診斷學(xué)等涉及形態(tài)學(xué)課程中，實驗教學(xué)使用顯微鏡的頻率極高。能夠熟悉顯微鏡的結(jié)構(gòu)并熟練使用和維護好顯微鏡，是學(xué)生上好形態(tài)學(xué)實驗課的前提[1]。筆者根據(jù)實驗教學(xué)體會，對生物光學(xué)顯微鏡使用過程中的常見問題及解決辦法進行分析。

1 顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)

雙目電光源生物顯微鏡基本結(jié)構(gòu)見圖1[2]。熟悉顯微鏡結(jié)構(gòu)是規(guī)范、熟練使用，克服、解決問題的基礎(chǔ)。

圖1 顯微鏡的結(jié)構(gòu)

2 顯微鏡的主要性能

2.1 定位精度

指一物鏡處在工作狀態(tài)，用轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)至另一物鏡時，視野中心的偏移量。如用10×物鏡調(diào)焦后，以其中心為基準，再轉(zhuǎn)換至40×物鏡時，中心位移不得超過該視場半徑的2/3，以40×物鏡為基準，轉(zhuǎn)換至100×物鏡時，中心位移不得超過該視場半徑的3/4。

2.2 齊焦精度

指一個物鏡調(diào)焦在工作位置后，轉(zhuǎn)換到其他物鏡時，應(yīng)在不重新調(diào)焦的情況下就能看到物像。

2.3 焦點深度

指視野中垂直范圍內(nèi)所能清晰觀察到的物象界限。當不用微調(diào)就能看清楚一個物像的平面及上下結(jié)構(gòu)，這個能夠看清的厚度即焦點深度。

2.4 鏡口率

指光線從聚光鏡經(jīng)載玻片折射后所成光線底面的孔徑數(shù)值，又稱數(shù)值孔徑。同樣條件下，放大倍數(shù)越大，鏡口率越低，光線越暗。

2.5 視野亮度

為了得到足夠視野亮度，必須用強光源并開大光柵，使充足的光源進入物鏡。同樣條件下，物鏡頭放大倍數(shù)越大，鏡口率越高，進入光線越少。因此，轉(zhuǎn)換物鏡頭時應(yīng)注意調(diào)整光線強度，使用油鏡頭時一定要添加香柏油。聚光鏡抬高接近物鏡頭可以增加亮度，如果亮度已經(jīng)足夠甚至過剩，可以縮小光圈，或者下調(diào)聚光鏡，但一般不降低底座光源強度，因為會使光源的顏色由白變黃，失去自然光屬性，改變物像的顏色。下調(diào)聚光鏡不僅可以降低亮度，還可以增加物像的對比度，使物像層次清晰。

3 顯微鏡使用三大原則

即先上后下，先高后低，先粗后細：（1）載物臺的高度從上往下調(diào)節(jié)，可避免壓碎載玻片；（2）物鏡頭轉(zhuǎn)換先低倍鏡后高倍鏡，便于定位目標；（3）先用粗調(diào)節(jié)螺旋找到大致的焦點范圍，再用細調(diào)節(jié)螺旋調(diào)節(jié)清晰的物像。

4 顯微鏡使用的常見問題及解決辦法

4.1 光源燈不亮

電光源顯微鏡的好處是借助于底座強烈的光線把標本照亮，經(jīng)適當?shù)恼{(diào)節(jié)可以清楚看到物像，但有時會出現(xiàn)故障。光源燈不亮原因在于：（1）電源沒接通；（2）插座插頭未插好；（3）開關(guān)未開；（4）調(diào)節(jié)閥未開；（5）燈泡損壞；（6）保險絲損壞等。

解決辦法：（1）使用帶指示燈的電源插座，每次使用顯微鏡之前仔細檢查是否接通電源。（2）將電源開關(guān)置于閉合狀態(tài)，指示為“開”字或“ON”字。（3）檢查調(diào)節(jié)電流強度（volume）的旋鈕是不是處于最小處（minimum），一般此調(diào)節(jié)鈕都是處于最高檔，光源發(fā)出白色光。（4）底座光源的燈泡使用壽命較短，工作時間久了會自然損壞，應(yīng)注意更換燈泡。養(yǎng)成隨手關(guān)閉光源的習(xí)慣，使用前打開，不需預(yù)熱，間隔5分鐘以上不用就要關(guān)閉電源。（5）如果使用帶延長線電源的插板，宜選用優(yōu)質(zhì)品牌，最好帶通電開關(guān)和指示燈。（6）保險絲燒斷，更換保險絲。

4.2 找不到物像

4.2.1 標本不在工作距離范圍內(nèi) 解決辦法：調(diào)高載物臺，載玻片與物鏡頭相接，慢慢下調(diào)，防止向下調(diào)節(jié)過快，沒有捕捉到物像。

4.2.2 目標不在視野范圍內(nèi) 解決辦法：（1）血細胞計數(shù)盤的劃線區(qū)域一定要對準物鏡頭；（2）較少的標本，涂片區(qū)域較小，觀察時要注意不要超出涂片范圍。

4.2.3 光線過于強烈或太暗 解決辦法：光線過于強烈，視野物像被“曝光”呈白色，適當降低光線強度，物像就會慢慢呈現(xiàn)出來。反之，用暗視野觀察物像時，注意避免物像被黑暗掩蓋。

4.2.4 聚光器偏離光軸 解決辦法：進行合軸調(diào)節(jié)使光線在目鏡、物鏡、聚光鏡、光柵這一光路的中心。

4.2.5 標本放反 在觀察細胞形態(tài)時，如白細胞分類通常使用油鏡觀察，但血涂片經(jīng)染色后，有的學(xué)生會把標本反放在載物臺上。因為油鏡頭鏡口率較小，需要標本非常接近油鏡頭，如果放反，物體超出了顯微鏡工作距離，無論如何也找不到物像。解決方法：（1）發(fā)現(xiàn)載玻片放反，直接翻轉(zhuǎn)過來；（2）在制作載玻片時在其一端做標記，防止觀察時放反。

4.2.6 觀察到的物像不見了 雖然使用顯微鏡能觀察到所要的物像，但一段時間后，卻找不到剛才的物像。此時有兩種情況：（1）顯微鏡的焦距仍正確，即視野內(nèi)其他物像仍清晰；（2）顯微鏡的焦距發(fā)生了改變，視野中不再有任何清晰的物像。解決方法：出現(xiàn)第一種情況的原因是臨時標本中的水較多，或顯微鏡鏡身傾斜角度過大，或者兩者兼而有之，使得標本中的物體在重力作用下向下移動，離開了視野范圍。此時可以稍微向上調(diào)節(jié)載物臺的高度，并將鏡身直立。出現(xiàn)第二種情況的原因可能是由于粗準焦螺旋軸上的齒輪與鏡筒上的齒條磨損松動，造成鏡筒自動下滑，需要實驗室技術(shù)人員修理。

4.3 視物模糊

視物模糊是由于光學(xué)系統(tǒng)受到污染，首先要判斷出污物存在的位置，才能有效排除。視野中出現(xiàn)異物有3種情況：物鏡上、目鏡上和載玻片上。（1）移動載玻片異物不動，說明污物不在載玻片上；（2）轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)換器，換上高倍鏡后，仍可觀察到，說明污物不在物鏡上，只可能存在于目鏡上；（3）如果轉(zhuǎn)動目鏡頭，污物也隨之轉(zhuǎn)動，則說明在目鏡頭上。

4.3.1 目鏡頭污染 解決辦法：用乙醚乙醇混合液擦拭鏡頭表面，直到消除。如果是內(nèi)部污染，則應(yīng)謹慎，這多是由于不慎打開目鏡頭，灰塵、水汽進入造成，可以用干燥的紗布擦拭或洗耳球吹洗。平時注意保持室內(nèi)干燥，防塵，避免從低溫環(huán)境直接進入高溫環(huán)境，防止形成冷凝水，發(fā)生霉變。

4.3.2 物鏡頭污染 解決辦法：（1）標本加樣不可太多，否則堆積在一起厚度較大，可以攤開平鋪，擴大面積，也易于尋找，避免目標重疊；（2）在不違反規(guī)則的情況下用低倍鏡觀察，因為使用低倍鏡時，物鏡頭距離觀察目標尚有一段安全距離，可以避免標本接觸物鏡頭；（3）加蓋蓋玻片，并且保持蓋玻片上方面的干燥；（4）油浸鏡頭使用后應(yīng)用擦鏡紙蘸二甲苯及時擦拭，如果干結(jié)，清潔難度較大，應(yīng)用擦鏡紙沾濕清潔液浸潤，擦拭時要用力。

4.4 機械故障

4.4.1 載物臺卡死 有些顯微鏡的高倍物鏡等焦處理不過關(guān)，導(dǎo)致在低倍鏡下看清物像轉(zhuǎn)換到高倍鏡時，高倍鏡與載玻片相碰，無法使用高倍鏡[3]。解決方法：打開粗調(diào)節(jié)螺旋，將載物臺上升到最高處，重新擰緊。

4.4.2 壓碎玻片 當載物臺上升到一定高度，載玻片與鏡頭“親密接觸”，已經(jīng)超過了物鏡頭的彈性范圍，最先受傷的只能是載玻片。解決辦法：遵循載物臺高度調(diào)節(jié)先上后下原則即可避免。

4.4.3 目鏡頭眼間距過小，不能雙眼觀察 出現(xiàn)這種情況主要是個別人眼間距太小，不能適應(yīng)正常擺放的顯微鏡的目鏡頭的眼間距，但目鏡頭進一步縮小受鏡架的阻擋，不能雙眼觀察。解決辦法：可以把固定目鏡的螺栓松動后旋轉(zhuǎn)180°，重新固定，進一步縮小兩目鏡頭的距離，適合眼間距窄的學(xué)生使用。

學(xué)生在使用顯微鏡的過程中出現(xiàn)問題在所難免，教師的任務(wù)是教會學(xué)生使用方法。除了在學(xué)生使用顯微鏡過程中出現(xiàn)問題能夠及時發(fā)現(xiàn)并加以解決外，實驗室工作人員對顯微鏡使用的登記管理及日常維護也是非常必要的[4，5]。