三角帆蚌糖蛋白的鹽溶液浸提及抗氧化活性

何曉梅， 喬德亮， 沈濤濤， 陳存武， 韋傳寶

（1.皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，安徽 六安 237012；2.植物細(xì)胞工程安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽 六安237012）

三角帆蚌糖蛋白的鹽溶液浸提及抗氧化活性

何曉梅1，2， 喬德亮1， 沈濤濤1， 陳存武1，2， 韋傳寶1

（1.皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，安徽 六安 237012；2.植物細(xì)胞工程安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽 六安237012）

以三角帆蚌臟器為試驗(yàn)材料，以NaCl溶液為提取溶劑，研究三角帆蚌臟器糖蛋白的低溫提取、分離及抗氧化活性。通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定三角帆蚌臟器糖蛋白最優(yōu)提取條件為：提取溫度4℃、NaCl溶液濃度0.3 mol/L、料液比1∶15、提取時(shí)間9 h。在此條件下，糖蛋白得率（以糖含量計(jì)）為（9.259±0.083）%，糖蛋白得率（以蛋白質(zhì)含量計(jì)）為（3.763±0.107）%。提取液經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀得三個(gè)組分糖蛋白粗品。體外抗氧化實(shí)驗(yàn)表明，三個(gè)組分都具有清除超氧陰離子自由基和羥基自由基的能力，但清除能力不同。10%SDS-PAGE電泳后經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R250和PAS染色，表明3個(gè)組分含有不同的糖蛋白譜帶。

三角帆蚌；糖蛋白；鹽溶液浸提；抗氧化活性；SDS-PAGE

三角帆蚌（Hyriopsis cumingii），俗稱三角蚌、珍珠蚌等，為我國(guó)特有種，廣泛分布于安徽、湖北、江西、湖南、浙江、江蘇等省大、中、小型湖泊及其周?chē)恿鲀?nèi)，尤以我國(guó)洞庭湖、鄱陽(yáng)湖、太湖、洪澤湖等湖泊產(chǎn)量較高[1]。三角帆蚌是我國(guó)優(yōu)良的淡水育珠品種，用它育成的珍珠不僅產(chǎn)量高而且質(zhì)量好[2]。而其采珠后的臟器，除了少部分被用于飼料外，其余部分都被拋棄。楊文鴿、周海燕等[3-4]分析三角帆蚌蚌肉的營(yíng)養(yǎng)成分表明，三角帆蚌蚌肉含有豐富的蛋白質(zhì)、糖類、維生素、必須氨基酸及錳、鐵、鋅、銅等微量元素，而脂肪含量較低，具有很好的食用價(jià)值和開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。另外，三角帆蚌多糖具有增強(qiáng)免疫力、抗氧化、抗腫瘤、抗菌等作用[5-9]。近年來(lái)，隨著對(duì)水生生物研究的深入和開(kāi)發(fā)技術(shù)的提高，對(duì)水生生物高值化開(kāi)發(fā)逐漸深入。繼水生生物多糖的研究，水生生物糖蛋白成為研究的又一熱點(diǎn)。糖蛋白是一類復(fù)合糖或一類綴合蛋白質(zhì)，糖鏈作為綴合蛋白質(zhì)的輔基。糖蛋白中糖可以相當(dāng)均勻地沿蛋白質(zhì)的多肽鏈分布，或集中在多肽鏈的特定區(qū)域[10]，其中糖鏈和肽鏈共同調(diào)控生物體的各種生物學(xué)活性。已有研究顯示，馬氏珍珠貝肉、菲律賓蛤仔肉、牡蠣肉、河蜆、海蜇等水生生物糖蛋白具有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抗腫瘤等[11-15]生物活性。目前，對(duì)三角帆蚌糖蛋白的提取、分離和生物活性研究未見(jiàn)報(bào)道。作者通過(guò)單因素和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化出三角帆蚌糖蛋白的最優(yōu)提取條件，并對(duì)其進(jìn)行初步分離，研究其體外生物活性，旨在為開(kāi)發(fā)高值化的三角帆蚌糖蛋白保健食品或藥物提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

三角帆蚌：購(gòu)自安徽和縣養(yǎng)殖場(chǎng)。剝殼后取全臟器，預(yù)冷雙蒸水洗滌，擠出水后切碎成肉末，再用高速組織搗碎機(jī)搗碎成蚌肉糜，分裝，于-40℃冰柜保存。

牛血清白蛋白：鹽城賽寶生物科技有限公司；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（≥98%）：貴州迪大國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心；考馬斯亮藍(lán)R250和低相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)：上海博谷生物科技有限公司；重蒸酚、Folin-酚試劑、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸、鄰苯三酚、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、鄰二氮菲、硫酸亞鐵、30%過(guò)氧化氫、濃硫酸、堿性品紅、偏重亞硫酸鈉、高碘酸、活性炭、甲醇、冰乙酸等試劑：均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

JJ-2組織搗碎機(jī)：江蘇金壇市億通電子有限公司；FA2104N電子分析天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；海爾BC/BD719H冰柜；GL-21M高速冷凍離心機(jī)：湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；UV-2000紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：尤尼柯上海儀器有限公司；美國(guó)Virtis臺(tái)式BenchTop Pro凍干機(jī)：德祥科技有限公司；DYCZ-24A電泳儀：北京六一儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 糖蛋白提取及初級(jí)分離參照胡雪瓊、包郁明等[16-17]的方法，取分裝的三角帆蚌肉糜于 4℃解凍，進(jìn)行鹽液浸提實(shí)驗(yàn)，每種方法重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。技術(shù)路線如下：原料解凍→鹽溶液浸提→離心（4℃、8 000 r/min、20 min），取上清液→硫酸銨分級(jí)沉淀（4℃過(guò)夜）→離心（8 000 r/min、20 min）→沉淀透析48 h（分別用AgNO3和BaCl2溶液檢測(cè)Cl-和SO42-）→聚乙二醇低溫（4℃）濃縮→-20℃冰凍→真空冷凍干燥→糖蛋白粗品。

1.3.2 糖蛋白的檢測(cè)NaCl提取液中含有糖蛋白、糖和蛋白質(zhì)，本研究計(jì)算糖蛋白得率，蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用福林酚法[18]。

以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.908 7x+0.006 7，R2= 0.999 2，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度小于0.5 mg/mL時(shí)線性關(guān)系良好。

同蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法，取1 mL糖蛋白浸提液測(cè)定其吸光度OD500nm，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算其質(zhì)量濃度為c蛋白質(zhì)。

糖蛋白得率 （以蛋白質(zhì)含量計(jì)）=（c蛋白質(zhì)×V×10-3）/m

式中，V為某一條件下浸提液總體積（mL）；m為某一條件下三角帆蚌肉糜質(zhì)量（g）。

總糖含量測(cè)定采用苯酚-硫酸法[19]。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖2。其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=13.765x+0.009 9，R2=0.999 1，葡萄糖質(zhì)量濃度小于0.09 mg/mL時(shí)線性關(guān)系良好。

圖1 蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of soluble protein content

圖2 總糖質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of total sugar content

同總糖質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法，取1 mL糖蛋白浸提液測(cè)定其吸光度OD490nm，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算其濃度為c總糖。

糖蛋白得率 （以糖質(zhì)量濃度計(jì)）=（c總糖×V×10-3×

0.9 ）/m

1.3.3 三角帆蚌臟器糖蛋白粗品抗氧化活性

1）超氧陰離子自由基（O2-·）清除率的測(cè)定：O2-·清除率的測(cè)定采用鄰苯三酚自氧化法[20]。

（O2-·）清除率=（V對(duì)照-V樣品）/V對(duì)照

式中，V樣品為樣品組鄰苯三酚自氧化速率（△A/ min）；V對(duì)照為對(duì)照組鄰苯三酚自氧化速率（△A/min）。

2）羥基自由基（·OH）清除率的測(cè)定：·OH清除率的測(cè)定采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法[21]。

·OH清除率=（A樣品-A損傷）/（A未損傷-A損傷）

1.3.4 10 g/dL SDS-PAGE電泳糖蛋白粗品的蛋白質(zhì)染色和多糖染色先后配制質(zhì)量濃度為10 g/dL的分離膠和5 g/dL的濃縮膠，穩(wěn)壓電泳，溴酚藍(lán)前緣進(jìn)入分離膠后，電壓由65 V調(diào)到85 V，直到溴酚藍(lán)前緣離底部1 cm停止電泳。蛋白質(zhì)采用考馬斯亮藍(lán)R-250染色，糖采用PAS染色[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 NaCl溶液濃度對(duì)糖蛋白得率的影響在料液比1∶12，浸提時(shí)間9 h，浸提溫度4℃（以下同）條件下，研究NaCl溶液濃度分別為0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1 mol/L時(shí)對(duì)糖蛋白得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 NaCl溶液濃度對(duì)糖蛋白得率的影響Fig.3 NaCl solution concentration on the influence of the extraction rate

當(dāng)NaCl溶液濃度小于0.3 mol/L時(shí)，糖蛋白得率隨濃度的增大而升高。當(dāng)NaCl溶液濃度大于0.3 mol/L時(shí)，糖蛋白得率呈下降趨勢(shì)，這可能是由于高鹽濃度條件下，細(xì)胞會(huì)因滲透作用失水，糖和蛋白質(zhì)不易脫離細(xì)胞膜溶到提取液中[23]，或者高鹽濃度使溶出的蛋白質(zhì)（包含糖蛋白）產(chǎn)生鹽析現(xiàn)象，而在低鹽濃度下，蛋白質(zhì)和糖（包含糖蛋白）較易溶出。由此確定NaCl溶液濃度大約在0.3 mol/L。

2.1.2 料液比對(duì)糖蛋白得率的影響在NaCl溶液濃度0.3 mol/L，浸提時(shí)間9 h條件下，研究料液比分別為1∶3、1∶6、1∶9、1∶12、1∶15、1∶18時(shí)對(duì)糖蛋白得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

當(dāng)料液比大于1∶12時(shí)，糖蛋白得率隨料液比減小而增加。因?yàn)殡S著溶劑量的增加，細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)形成的濃度差越大，胞內(nèi)物質(zhì)擴(kuò)散越快，浸出物越多，浸提液中糖和蛋白質(zhì)含量越高。但當(dāng)料液比小于1∶12時(shí)，即隨著溶劑量的繼續(xù)增加，糖蛋白得率增加緩慢，趨于平衡，可能是由于雜質(zhì)浸出量的增加，同時(shí)，考慮到溶劑量過(guò)高，不利于后續(xù)濃縮、純化等過(guò)程。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇料液比為1∶12。

圖4 料液比對(duì)糖蛋白得率的影響Fig.4 Solid-liquid ratio on the influence of the extraction rate

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)糖蛋白得率的影響在NaCl溶液濃度0.3 mol/L，料液比1∶12條件下，研究提取時(shí)間分別為3、6、9、12、15、18 h時(shí)對(duì)糖蛋白得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 提取時(shí)間對(duì)糖蛋白得率的影響Fig.5 Extraction time on the influence of the extraction rate

在實(shí)驗(yàn)研究的時(shí)間范圍內(nèi)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，糖蛋白得率升高。當(dāng)提取時(shí)間小于6 h時(shí)，糖蛋白得率升高迅速，9 h以后趨于平緩，綜合考慮效率和得率因素，提取時(shí)間宜選擇6 h。

2.1.4 提取次數(shù)對(duì)糖蛋白得率的影響在NaCl溶液濃度0.3 mol/L，料液比1∶12，提取時(shí)間6 h條件下，對(duì)三角帆蚌臟器進(jìn)行3次浸提，糖蛋白得率見(jiàn)圖6。隨著提取次數(shù)的增加，總糖蛋白得率增加，但經(jīng)過(guò)一次浸提，糖蛋白得率分別達(dá)到 （9.258± 0.820）%（以糖含量計(jì)）和（3.538±0.764）%（以蛋白質(zhì)含量計(jì)），其后兩次浸提，糖和蛋白質(zhì)溶出率較低。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇一次浸提。

圖6 提取次數(shù)對(duì)糖蛋白得率的影響Fig.6 Extraction times on the influence of the extraction rate

2.2 正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果及分析

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1、表2。

表1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of orthogonal experiment

方差分析結(jié)果見(jiàn)表2。極差（R糖、R蛋白質(zhì)）分析表明，影響糖蛋白得率（以糖含量計(jì)）因素主次順序?yàn)椋毫弦罕龋咎崛r(shí)間＞NaCl溶液濃度；影響糖蛋白得率（以蛋白含量計(jì)）因素主次順序?yàn)椋篘aCl溶液濃度＞料液比＞提取時(shí)間。方差分析結(jié)果表明，各因素對(duì)糖蛋白得率都不顯著。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，糖蛋白的最優(yōu)提取條件為A2B3C3，即NaCl溶液濃度為0.3 mol/L、料液比為1∶15、提取時(shí)間為9 h。在此條件下進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，糖蛋白得率（以糖含量計(jì)）為（9.259±0.083）%，糖蛋白得率（以蛋白質(zhì)含量計(jì)）為（3.763±0.107）%。

表2 方差分析表Table 2 Analysis of variance

2.3 硫酸銨分級(jí)沉淀

在正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化條件下的提取液中加入硫酸銨固體進(jìn)行分級(jí)沉淀 （4℃、12 h），得到三個(gè)組分P1、P2、P3糖蛋白粗品，結(jié)果見(jiàn)表3。對(duì)于相同體積的浸提液，分別加入不同質(zhì)量的硫酸銨后，P1、P2、P3得率依次增大；且隨著硫酸銨飽和度的增加，P1、P2、P3三組分中蛋白質(zhì)和總糖含量也隨著增加，且蛋白質(zhì)得率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于總糖得率。沉淀物顏色由乳白色漸變?yōu)榛液稚?。（P1組分為飽和度為0～30%硫酸銨沉淀物；P2組分為飽和度為30%～60%硫酸銨沉淀物；P3組分為飽和度為60%～90%硫酸銨沉淀物。）

表3 三角帆蚌臟器糖蛋白的硫酸銨分級(jí)沉淀Table 3 Organ glycoprotein of hyriopsis cumingii by ammonium sulfate precipitation

2.4 三角帆蚌臟器糖蛋白抗氧化活性

2.4.1 清除超氧陰離子自由基能力的分析在本實(shí)驗(yàn)研究條件下得到的三個(gè)不同組分糖蛋白粗品（P1、P2、P3）對(duì)超氧陰離子自由基的清除率見(jiàn)圖7。結(jié)果表明，隨著質(zhì)量濃度的增加，其清除率逐漸增加，但在相同質(zhì)量濃度下，其清除率強(qiáng)弱順序?yàn)椋篜3＞P2＞P1，且P1組分清除率較P2、P3組分清除率弱得多，這可能與不同組分糖蛋白的有效含量有關(guān)，當(dāng)P3組分質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL時(shí)，其清除率達(dá)到（82.520±1.320）%。

圖7 不同糖蛋白組分清除超氧陰離子自由基能力Fig.7 Scavenging activities on superoxide anion radical of glycoprotein from different composition

2.4.2 清除羥基自由基能力的分析圖8顯示了在實(shí)驗(yàn)研究質(zhì)量濃度范圍內(nèi)三個(gè)不同組分糖蛋白粗品（P1、P2、P3）對(duì)羥基自由基的清除率。在質(zhì)量濃度小于600 μg/mL，各組分對(duì)羥基自由基的清除率增加比較明顯；質(zhì)量濃度大于600 μg/mL時(shí)，各組分對(duì)羥基自由基的清除能力有增大趨勢(shì)但較平緩。當(dāng)P3組分質(zhì)量濃度為800 μg/mL時(shí)，其清除率達(dá)到（51.030±1.290）%。

圖8 不同糖蛋白組分清除羥基自由基能力Fig.8 Scavenging activitieson hydroxylradicalof glycoprotein from different composition

2.510 g/dL SDS-PAGE檢測(cè)P1、P2和P3組分

抗氧化性實(shí)驗(yàn)表明：相同質(zhì)量濃度下，P2和P3組分具有較P1組分更強(qiáng)的清除自由基（O2-·、·OH）能力。作者分別稱取經(jīng)真空冷凍干燥的P1、P2和P3組分各50 mg溶于2.5 mL蒸餾水中，室溫下超聲波處理10 min，然后加入同體積的2×樣品上樣緩沖液，煮沸10 min后 （12 000 r/min離心10 min），取20 μL電泳，結(jié)果見(jiàn)圖9。

圖9 10 g/dL SDS-PAGE電泳及染色結(jié)果Fig.9 Results of 10 g/dL SDS-PAGE electrophoresis and staining

組分P1、P2、P3經(jīng)過(guò)10 g/dL SDS-PAGE電泳后，切膠，其中一部分進(jìn)行PAS染色，另一部分進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色。結(jié)果顯示，P3有4條比較明顯的PAS染色條帶與其考馬斯亮藍(lán)染色條帶位置一致，P2有2條比較明顯的PAS染色條帶與其考馬斯亮藍(lán)染色條帶位置一致，且P2與P3有2條PAS染色條帶位置一致，其最大相對(duì)分子質(zhì)量介于66 200～116 000，另一條帶相對(duì)分子質(zhì)量大約為45 000，P1組分幾乎看不到PAS染色條帶，其原因可能與P1組分中糖蛋白質(zhì)量濃度較低有關(guān)。另外，考馬斯亮藍(lán)染色條帶4，5，6比較顯示，P3蛋白質(zhì)量濃度高于P2和P1。

3 結(jié)語(yǔ)

以總糖和蛋白質(zhì)糖蛋白得率為考察指標(biāo)，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)確定糖蛋白最優(yōu)提取條件為：提取溫度4℃、NaCl溶液濃度0.3 mol/L、料液比1∶15、提取時(shí)間9 h。在此條件下，糖蛋白得率（以糖含量計(jì)）為（9.259±0.083）%，糖蛋白得率（以蛋白質(zhì)含量計(jì)）為（3.763±0.107）%。提取液經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀，離心、透析、濃縮、真空冷凍干燥得3個(gè)組分糖蛋白粗品，3個(gè)組分中蛋白質(zhì)和糖含量不同。

體外抗氧化實(shí)驗(yàn)表明，3個(gè)組分都具有清除超氧陰離子自由基和羥基自由基的能力，但清除能力不同，在實(shí)驗(yàn)研究的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，60%～90%飽和度的硫酸銨沉淀物抗氧化活性最強(qiáng)，有待進(jìn)一步研究其組成和結(jié)構(gòu)。

10 g/dL SDS-PAGE電泳三個(gè)組分后經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R250和PAS染色，初步表明3個(gè)組分含有的糖蛋白譜帶不同，且0～30%飽和度的硫酸銨沉淀物中沒(méi)有檢測(cè)出糖蛋白。

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Salty Extraction and Antioxidant Activities of Glycoprotein from Hyriopsis cumingii

HE Xiaomei1，2， QIAO Deliang1， SHEN Taotao1， CHEN Cunwu1，2， WEI Chuanbao1
（1.College of Biology and Pharmaceutical Engineering，West Anhui University，Lu'an 237012，China；2.Anhui Province Engineering Technology Research Center of Plant Cell Engineering，Lu'an 237012，China）

Hyriopsis cumingii visceral organ and Nacl solution were used as material and extraction liquor to study the hyriopsis cumingii glycoprotein extraction and separation under low temperature and the antioxidant activity.Through single factor experiment and orthogonal experiment，the optimized extraction condition was as below：extraction temperature at 4℃，0.3 mol/L NaCl solution，solid-liquid ratio in 1∶15，and extraction for 9 h.Glycoprotein extraction rates under optimal condition interms of sugar content and protein content were （9.259±0.083）%and（3.763±0.107）% respectively.Crude glycoprotein sample，thatcomprisesthree different components，was obtained，after the extraction liquor was fractionally precipitated by ammonium sulfate.The different component had a different ability to scavenge surperoxide anion radicals and hydroxyl radicals.Crude glycoprotein sample was Electrophoresed by 10%SDS-PAGE and dyed byCoomassie Brilliant Blue R250 and PAS，and the result showed the three components contained different glycoprotein bands.

Hyriopsis cumingii，glycoprotein，salty extraction，antioxidant activities，SDS-PAGE

TS 24

A

1673—1689（2015）05—0517—07

2014-02-06

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 （31271853）；安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目 （KJ2013B341，1308085MC33）；省級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目（AH201410376006）；安徽壽縣扶貧開(kāi)發(fā)項(xiàng)目（WXZQ1421）；皖西學(xué)院科技創(chuàng)新平臺(tái)項(xiàng)目（0044013010）。

何曉梅（1974—），女，安徽霍山人，理學(xué)碩士，講師，主要從事天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)方面的研究。E-mail：happyzh@wxc.edu.cn